摘要
目的: 本研究以三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)为例探索黄芽汤治疗乳腺癌的药效物质基础和作用机制，以期为TNBC提供新的治疗靶点和生物标志物，并完善相应的研究模式。 方法: 1.筛选疾病靶点:首先应用疾病-基因关联数据库DisGeNET检索TNBC疾病靶点。由癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库获得TNBC样本的转录组数据，在R语言环境下用limma包筛选差异表达基因，并与检索得到的TNBC疾病靶点合并去重。 2.筛选中药成分及其靶点:应用中药系统药理学(Traditional Chinese Medicine Systems pharmacology,TCMSP)和中医百科全书(Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine,ETCM)数据库以药物名为检索词，依据药物有效成分筛选原则进行有效成分筛选，并进一步筛选有效成分的作用靶点。 3.分子网络构建和分析:将中药作用靶点与疾病靶点取交集。应用蛋白互作数据库(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING)对交集靶点进行分子网络构建。应用 clusterProfiler 包和 ggplot2 包对蛋白质互作(protein-protein interaction,PPI)网络进行基因本体论(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)等功能富集分析及可视化。从 STRING下载PPI网络的tsv格式文件导入Cytoscape软件，应用Cytoscape-Centiscape执行Degree分析，应用Cytoscape-MCODE执行模块识别等。 4.确认核心靶点及其差异表达:结合分子网络特征和差异表达分析情况筛选核心靶点。进一步使用UALCAN数据库验证核心靶点的差异表达情况。 5.核心靶点集合的获取和分析:应用STRING数据库对核心靶点进行网络构建和功能富集分析。结合Pearson相关性分析和文献研究确认核心靶点集合内的关键靶点。使用 Kaplan-Meier(K-M)Plotter(http://kmplot.com/analysis/)评估该关键靶点对TNBC的预后价值。 结果: 1.疾病靶点和药物靶点:本研究筛选得到436个TNBC差异表达基因，由DisGeNET数据库检索得到1598个TNBC疾病靶点,合并去重后共计为1930个TNBC疾病靶点。黄芽汤内人参、茯苓、干姜、甘草所含有效成分依次为17个、11个、13个、10个，对应靶点依次为97个、34个、55个和163个，合并去重后的药物靶点共计226个。 2.分子网络及其功能:药病交集靶点共计65个并构建了相应的PPI网络，PPI网络的KEGG富集分析显示这些靶点不仅涉及免疫调节、糖脂代谢，且与多个癌症和癌症重要通路直接相关。GO分析显示涉及的生物学途径主要有调控细胞周期和有丝分裂，负调控细胞凋亡，调控上皮细胞的增殖，血管生成和发育，调节细胞间粘附,并涉及免疫调节和对氧含量降低的反应。 3.网络内核心靶点及其差异表达验证:MCODE分析显示该分子网络存在5个区域模块。结合差异表达情况在识别的5个区域模块中筛选得到7个高表达核心靶点:BIRC5、CCNA2、CCNB1、E2F1、MMP1、MMP9、TOP2A。UALCAN 数据库分析进一步表明这些核心靶点在各乳腺癌亚型中几乎全部高表达，且在TNBC中的上调程度高于非TNBC乳腺癌。Degree分析显示核心靶点BIRC5和E2F1在网络中的连通度较高，CCNB1和CCNA2紧随其后。 4.核心靶点集合及其功能:当设置Cofidence=0.9时7个核心靶点的PPI拓扑网络显现出一个核心靶点集合，包括BIRC5、CCNA2、CCNB1、E2F1、TOP2A。功能富集分析显示该集合与细胞增殖等细胞周期调控密切相关，涉及G1/S期和G2/M期多个重要通路，例如 Positive regulation of cell population proliferation(GO:0008284),Cell cycle(KEGG:hsa04110),Mitotic G1 phase and G1/S transition(Reactome:HSA-453279),Mitotic G2-G2/M phases(Reactome:HSA-453274),E2F mediated regulation of DNA replication(Reactome:HSA-113510)。 5.核心靶点集合内部关联及关键靶点:E2F1分别与核心靶点BIRC5、CCNA2、CCNB1、TOP2A之间呈表达正相关。文献研究表明E2F1作为转录调控因子可与BIRC5、CCNA2、CCNB1、TOP2A的启动子结合执行转录调控。结合相关性分析结果和既往文献研究，E2F1被作为上述集合的关键靶点。生存分析显示集合内关键靶点E2F1对TNBC具有一定预后价值（logrankp=0.042）,高表达组预后较差。 6.核心靶点与黄芽汤有效成分的分子对接情况:分子对接结果显示黄芽汤多个有效成分均可作用于上述核心靶点集合，这些有效成分在黄芽汤组方四味药中均有分布。此外本研究注意到集合内关键靶点E2F1对应其中的有效成分仅有quercetin（槲皮素，结合能-8.3）,两者结合活性较好。实验表明槲皮素可以抑制TNBC细胞增殖、迁移和侵袭，并促进TNBC细胞凋亡。进一步的分子实验表明槲皮素干预下TNBC细胞中E2F1在转录水平和蛋白水平均下调。既往研究表明E2F1可以通过其启动子内存在的E2F结合位点诱导其自身的转录，本研究认为这是E2F1转录水平随之下降的重要原因。 7.核心靶点的进一步分析 （1）临床特征分析显示核心靶点与乳腺癌样本的分期、人种、性别、年龄、淋巴结转移等方面存在不同程度的相关性。尤其是核心靶点在乳腺癌早期即呈明显上调，具有成为诊断生物标志物的潜力。进一步诊断价值评估显示7个核心靶点均对乳腺癌具有较好的诊断价值，曲线下面积（area under the curve,AUC）最小值为0.832。 （2）核心靶点集合在乳腺癌免疫浸润相关性分析中也具有相似表现，集合内所有核心靶点均与Th2细胞呈显著正相关，并与NK细胞呈一定程度的负相关。这提示了该集合过表达靶点的下调可以辅助纠正Th1和Th2偏移所致促癌作用，并能够辅助NK细胞疗法治疗TNBC,有助于继续开展相关免疫疗法的研究。 （3）泛癌分析显示7个核心靶点在乳腺癌以外的多个癌种中呈高表达并与多个癌种预后相关，且大都高表达组预后较差。该结果提示这些核心靶点在癌症中扮演了重要角色，并为其深入开发和应用提供了重要指向。 结论: 1.本研究在网络药理学和生物信息学的支持下，以临床问题为导向联合数据库分析和针对性实验，有效探索了黄芽汤治疗TNBC的药效物质基础和分子机制，并围绕核心靶点进行多重分析和表征，为TNBC提供了治疗靶点、预后因子和诊断生物标志物。这一模式为中医药相关研究提供了参考。 2.黄芽汤对TNBC的干预作用具有多途径、多靶点的特征，分子网络的7个核心靶点是 E2F1、BIRC5、CCNA2、CCNB1、TOP2A、MMP1、MMP9。以上 7 个核心靶点在各乳腺癌亚型中几乎全部高表达，且在TNBC中的上调程度高于非TNBC乳腺癌。结合核心靶点的功能来看，这一分子特征与TNBC亚型恶性程度较高、病情进展迅速密切相关。此外7个核心靶点均对乳腺癌具有较好的诊断价值（AUC最小值为0.832）。 3.核心靶点 BIRC5、CCNA2、CCNB1、E2F1、TOP2A 构成了黄芽汤干预 TNBC的一个显著集合（Cofidence=0.9）。该过表达集合呈现出正相关、转录调控、功能协同等一系列特征。（1）该集合与细胞增殖等细胞周期调控密切相关，文中列举了所涉G1/S期和G2/M期多个重要通路。（2）E2F1分别与集合内其余核心靶点（BIRC5、CCNA2、CCNB1、TOP2A）呈表达正相关。（3）E2F1作为Rb-E2F信号通路调控细胞增殖过程中的重要转录因子能够与BIRC5、CCNA2、CCNB1、TOP2A的启动子结合执行转录调控，在上述核心靶点集合中居于关键位置。（4）集合内关键靶点E2F1还对TNBC具有一定预后价值，高表达组预后较差。 4.黄芽汤组方四味药中不仅有多个有效成分可以作用于所获核心靶点集合，而且其中有效成分槲皮素还可以通过下调E2F1降低核心靶点集合的整体表达水平，从而起到共同阻滞细胞增殖的作用进而抑制TNBC进展。结合该过表达集合正相关、转录调控、功能协同等一系列特征，这从分子层面上阐释了黄芽汤干预TNBC的药效物质基础和作用机制，并体现了中药复方的配伍优势。
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