摘要
鸡球虫病是当前危害养鸡业肠道健康的重要疾病之一，每年对我国养鸡业造成超过35亿元的经济损失。鸡球虫病弱毒活卵囊疫苗免疫是当前最有效的鸡球虫病绿色防控策略之一，目前对鸡球虫病活卵囊疫苗的生产只能通过鸡体传代的方式，传代过程中的卵囊交叉污染（感染野毒虫株或其它虫种）是严重影响活卵囊疫苗产品质量的关键因素。然而目前尚无有效特异性鉴别疫苗虫株的手段，建立一套检测疫苗虫株的定量方法成为鸡球虫病活卵囊疫苗生产及应用的迫切需求。鉴于此，本研究以毒害艾美耳球虫虫种为研究对象，利用二代测序技术对毒害艾美耳球虫EnYS疫苗株进行全基因组测序，利用生物信息学技术筛选疫苗虫株的特异性标记基因，从而建立TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法，以期为鸡球虫病活卵囊疫苗的生产及应用和疫苗虫株的知识产权保护提供技术支撑及方法基础。主要内容如下: 1、毒害艾美耳球虫EnYS疫苗株特异性标记基因的筛选和验证。通过对毒害艾美耳球虫EnYS疫苗株进行全基因组测序，针对测序结果筛选特异性标记基因，并对标记基因进行PCR扩增与测序鉴定，筛选得到的7个分子标记基因设计了 7对引物。PCR产物电泳结果得出En-marker5和En-marker6片段大小符合预期。PCR产物送测序，比对测序分析序列后选择En-marker5作为特异性标记基因，为后期实验探针和引物设计提供依据。 2、EnYS株TaqMan荧光定量PCR方法建立和体系优化。通过前期筛选出毒害艾美耳球虫EnYS疫苗株的标记基因marker5,我们对其进行引物和探针设计，并在TaqMan荧光定量PCR体系中摸索引物和探针的最适使用浓度。优化得到该方法的最佳探针浓度是250nmol/L,上下游引物浓度均为500 nmol/L,最终建立最佳TaqMan荧光定量PCR反应体系:在10μL qPCR反应体系,包含Premix Ex Taq 5μL,Probe 1 μL,ddH2O 1 μL,上下游引物各0.5μL，核酸模板1μl，结果显示本方法体系可以稳定扩增En-marker5基因，为下一步方法的参数优化提供技术支撑。 3、EnYS株TaqMan荧光定量PCR方法的参数优化。对建立的TaqMan荧光定量PCR方法中的特异性、敏感性、重复性进行优化，首先建立TaqMan荧光定量PCR标准曲线;其次，对不同外源虫种和不同常见肠道病原微生物进行特异性分析，结果显示，本方法可特异性扩增EnYS疫苗株，对其它鸡球虫外源虫种和常见肠道病原微生物扩增均为阴性;进而采用卵囊基因组DNA和靶标序列质粒分别进行梯度稀释以确定方法的敏感性，结果显示本方法可最小检出限为50个卵囊/μL,质粒检出下限为2.9×102copies/μL;最后采用 3 种不同浓度(2.9×104copies/μL,2.9×105copies/μL,2.9×106 copies/μL)的质粒模板进行了三次组内和组间的重复检测，变异系数都小于3％,验证了该鉴定方法的重复稳定性。最后，随机选择80份临床样品进行测试，EnYS疫苗株鉴定阳性率为100.0％(36/36),其余外源虫株样本均无特异性扩增。结果表明本研究所建立EnYS TaqMan荧光定量PCR方法具有敏感性、特异性和重复性强的特点，适合用于临床样品的检测。 综上，本研究建立了毒害艾美耳球虫疫苗株(EnYS株)TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法，能够有效区分EnYS疫苗株与外源虫株，具有较高的特异性、敏感性和稳定性，为鸡球虫病活卵囊疫苗生产和使用过程中质量控制提供重要技术支撑。
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