园林水体景观在园林造景中具有重要地位，重金属污染会严重破坏园林水体生态系统，影响观景效果。绿藻作为生物修复材料具有成本低、效率高、无二次污染以及操作简单等优点，研究绿藻对镉(Cd)和铅(Pb)胁迫的响应机制，有利于提高生物修复技术在改善园林水生生态系统中的应用。本研究以蛋白核小球藻、普通小球藻、狭形纤维藻、尖细栅藻、四尾栅藻和斜生四链藻等13种绿藻为材料，分析在不同浓度梯度Cd/Pb胁迫下13种绿藻的长势及生理指标变化。结果发现蛋白核小球藻耐受Cd/Pb的能力较强，并通过扫描和透射电镜观察其在Cd/Pb处理下的微观形态变化。重金属离子分析结果表明尖细栅藻累积Cd/Pb量均较高，后对Cd/Pb胁迫下的蛋白核小球藻和尖细栅藻进行转录组测序并分析。主要研究结果如下: (1)通过长势分析发现，在200μM Cd处理下，蛋白核小球藻、耐盐碱小球藻和普通小球藻等5种藻仍能保持缓慢生长，其他绿藻的生长则被完全抑制，随着Cd浓度的增加上述绿藻逐渐褪绿，在600μM Cd处理下，仅蛋白核小球藻与原球藻能够存活，且蛋白核小球藻长势更好;而300μMPb处理下，除尖细栅藻、狭形纤维藻、空星藻、盘星藻和斜生四链藻外，其余绿藻均能生长，但与未处理组相比长势较弱。随着Pb浓度的增加，大多数绿藻开始褪绿，长势也受到明显抑制。在700μM Pb处理下，其余绿藻均被抑制生长，仅蛋白核小球藻、普通小球藻和原球藻仍能存活，并且蛋白核小球藻长势最好。说明蛋白核小球藻较其他绿藻能同时耐受高浓度的Cd/Pb胁迫。 (2)通过扫描和透射电子显微镜观察Cd/Pb处理后的蛋白核小球藻和斜生四链藻细胞(对照藻，对Cd/Pb处理敏感)的超微结构，结果表明在未处理的两种绿藻中，蛋白核小球藻呈圆形球体，表面光滑，斜生四链藻细胞呈梭形，表面有褶皱，细胞结构完整。Cd/Pb处理的蛋白核小球藻细胞表面出现萎缩，但没有破裂，细胞壁仍完整，细胞内部结构较稳定，Cd处理细胞有淀粉粒积累。而Cd/Pb处理的斜生四链藻细胞受损较严重，细胞变形，细胞壁破裂，细胞结构也被严重破坏，淀粉粒积累较多。说明蛋白核小球藻与斜生四链藻相比具有较强的Cd/Pb耐受性。 (3)测定13种绿藻在Cd/Pb处理下的还原型谷胱甘肽(GSH)含量以及过氧化物酶(POD)活性，结果表明Cd/Pb处理的蛋白核小球藻的GSH含量均高于未处理组，但其他绿藻在Cd/Pb处理后的GSH含量与未处理组相比未均表现出显著提高。另外，Cd/Pb处理下，蛋白核小球藻、耐盐碱小球藻、普通小球藻、原球藻、莱茵衣藻和四尾栅藻的POD活性均显著提高，其中蛋白核小球藻的POD活性最高。这一结果说明蛋白核小球藻的Cd/Pb耐受性高于其他绿藻，推测蛋白核小球藻重金属解毒可能与GSH含量及POD活性增加有关。 (4)通过重金属离子含量结果可以发现尖细栅藻在Cd/Pb处理下累积Cd/Pb的含量显著高于其他多数绿藻，说明尖细栅藻对Cd/Pb具有较强的吸收和累积能力。但是抗性分析以及生理指标结果表明，尖细栅藻对重金属耐受能力偏弱，因此我们推测尖细栅藻吸收过量的Cd/Pb使得细胞受毒害影响较大，导致藻细胞生长受限甚至死亡。 (5)蛋白核小球藻转录组结果分析可知，在Cd/Pb处理下，GO和KEGG富集分析发现“过氧化物酶体”与“硫代谢”通路均有较高富集。RT-qPCR结果显示抗氧化酶基因CpSAT、CpSBP、CpKAT2、Cp2HPCL、CpACOX、CpACOX2和CpACOX4在Cd/Pb胁迫下表达量上调,表明上述代谢通路和基因在蛋白核小球藻重金属解毒过程中发挥重要作用。而尖细栅藻的转录组分析显示“蛋白酶体”均普遍富集，我们推测尖细栅藻可能通过蛋白酶体清除活性氧缓解重金属毒性，但因累积重金属过多导致尖细栅藻对Cd/Pb的耐受性较弱。 综上所述，抗性分析表明蛋白核小球藻对Cd/Pb的耐受性较强，同时Cd/Pb胁迫下GSH含量及POD活性显著高于其他绿藻，综合转录组结果我们推测，蛋白核小球藻可能通过硫代谢过程合成植物螯合肽螯合细胞内游离的重金属，并且硫代谢过程中的H2S可促进过氧化物酶体生成抗氧化酶，通过提高细胞抗氧化能力缓解氧化应激反应以实现对重金属解毒。尖细栅藻吸收Cd/Pb离子能力较强，结合转录组结果分析，我们推测尖细栅藻可通过蛋白酶体去除被重金属损坏或者错误折叠的蛋白质来缓解重金属毒性，且尖细栅藻适用于低Cd/Pb污染园林水体的治理。目前，蛋白核小球藻耐受Cd/Pb的分子机制和尖细栅藻累积重金属的分子机制仍有待研究。本研究将有助于挖掘新的潜在微藻株和抗逆基因用于修复园林水体中有毒重金属污染。
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