摘要
背景： 卵巢早衰（PrematureOvarianFailure,POF）是目前女性常见疾病之一，也是年轻女性面临的影响生育能力及生活质量的重大难题，临床主要以月经稀发甚至闭经、不孕为特点。随着社会、经济的快速发展，环境因素影响，女性生育年龄推后，生活及精神压力增大等原因，卵巢早衰的发病率逐年上升，且呈现出明显的年轻化趋势。卵巢早衰的主要发病机制是卵泡闭锁，而颗粒细胞功能的减退会导致并加速卵泡的闭锁。先前有研究表明，POF发生的诱因之一是卵巢局部抗氧化系统功能异常，而氧化应激会影响细胞的增殖、分化及凋亡。姜黄素是一种天然二酚类化合物,其药理学作用较为广泛，具有抗炎、抗癌、抗氧化、降血脂、神经细胞保护等作用，姜黄素可以缓解卵巢内的氧化应激，进而改善氧化应激对组织细胞的损伤，但其具体分子作用机制尚不明确。 目的： 本文首先使用KGN细胞系研究姜黄素对氧化损伤的颗粒细胞的增殖和凋亡的影响，进而探究其改善卵巢氧化损伤的作用，并确定姜黄素对颗粒细胞抗氧化的有效浓度及时间。然后进行蛋白质组学分析，筛选具有显著差异性的蛋白，并进一步探究姜黄素治疗POF的潜在靶标和分子作用机制。 方法： 1.选用人卵巢颗粒细胞系KGN细胞，利用过氧化氢（H2O2）构建KGN氧化损伤的模型：选取不同作用浓度和时间的H2O2干预KGN细胞，CCK-8（CellCountingKit8）法检测细胞存活率，确定H2O2造模的时间和浓度。 2.确定姜黄素对颗粒细胞抗氧化的有效浓度及时间。在氧化模型的基础上，配置不同种浓度的姜黄素分别培养KGN细胞，并分别在培育24、48、72、96h后用CCK-8法检测细胞存活率。 3.在流式细胞检测仪上，姜黄素干预后的细胞使用AnnexinV-FITC/PI试剂盒进行双染色，上机检测KGN细胞凋亡率。将处理后的细胞收集并装载活性氧荧光探针DCFH-DA后，上机检测荧光强度，计算细胞内活性氧水平。 4.利用数据非依赖采集（Dataindependentacquisition,DIA）定量蛋白质组学技术，对获取的蛋白质进行鉴定和定量，筛选差异表达蛋白，并通过Blast2GO软件对差异蛋白进行基因本体（GeneOntology,GO）功能注释，利用KOBAS软件对其进行京都基因和基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG）通路注释及富集分析，寻找姜黄素通过缓解颗粒细胞氧化应激损伤来改善POF的潜在作用靶点及信号通路。 结果： 1.采用H2O2诱导KGN细胞构建氧化应激损伤模型，当H2O2浓度为400μmol/L,刺激时长为0.5h时,细胞的存活率为51.45±2.15%,故以此作为后续实验的建模条件。 2.CCK-8法结果显示，与正常组相比，H2O2组和DMSO组（溶剂对照组）细胞存活率明显下降（Plt;0.001）；与DMSO组相比，2μmol/L-10μmol/L浓度的加药组的细胞存活率明显升高，且呈时间依赖性（Plt;0.05）。 3.流式细胞术结果显示，与正常组相比，H2O2组和DMSO组细胞总凋亡率及荧光强度明显升高（Plt;0.01）；与DMSO组相比，加药组细胞的总凋亡率及细胞内荧光强度均降低，差别具统计学意义（Plt;0.05），这表明姜黄素能有效降低H2O2诱导的KGN细胞的凋亡率和细胞内活性氧水平。 4.蛋白鉴定和定量分析结果显示，两组样本共检测出6074个蛋白，具有显著性差异（Pvaluelt;0.05）的蛋白共138个，其中表达上调的蛋白38个，表达下调的蛋白100个。 5.结构域富集分析结果显示：差异蛋白主要富集在纤维蛋白原α/β链家族、纤维蛋白原β/γ链的C-末端球状结构域和小细胞因子(干扰素/趋化因子，白细胞介素-8家族）这三类结构域。 6.GO分析结果表明，差异表达蛋白共注释到326种生物学过程、64种分子功能和22种细胞组分；其中在生物学过程中，差异蛋白富集最为显著的主要是内皮细胞凋亡过程的负向调控、异型细胞-细胞黏附的正向调控、诱导细菌凝集、纤维蛋白溶解和纤溶酶原活化这五个过程；其生物分子功能主要涉及到：细胞因子活性、细胞因子活性、鸟苷酸转移酶活性和泛素样蛋白连接酶活性；差异表达蛋白主要定位在纤维蛋白原复合物、PAM复合体/TIM23线粒体导入马达、鸟苷-核苷酸交换因子复合物以及胞内转运粒子B等方面。 7.KEGG通路分析显示,姜黄素治疗POF的潜在作用通路主要涉及紧密连接、生物素代谢、细胞因子-细胞因子受体相互作用、补体和凝血级联、糖鞘脂生物合成-乳酸和新乳酸系列、肌醇磷酸盐代谢、脂肪酸延伸、hippo信号通路-多物种、癌症中的胆碱代谢、磷脂酰肌醇信号系统、不饱和脂肪酸的生物合成、JAK-STAT信号通路、血小板激活等多条信号通路。 结论： 1、姜黄素能够有效缓解H2O2诱导的KGN细胞氧化损伤，促进颗粒细胞活力恢复，抑制颗粒细胞的凋亡，降低细胞内活性氧水平。 2、本项目通过蛋白组学技术，筛选出5个潜在的作用蛋白：TRMT61B、OXSM、BOLA2、RNF121、COMMD2。其中TRMT61B、OXSM、BOLA2均为上调表达蛋白，且与ROS的主要产生场所线粒体密切相关，推测其可能是姜黄素改善卵巢氧化应激的主要作用靶点。而RNF121与COMMD2与NF-κB信号通路有关联。 3、根据KEGG通路分析结果和文献研究，初步认为，参与姜黄素改善POF的作用途径主要有：生物素代谢、补体和凝血级联、JAK/STAT信号通路和Hippo信号通路。
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