摘要
研究目的： 1.明确临床效验方HJ11治疗冠心病的疗效，通过制备大鼠缺血再灌注模型，使用HJ11方进行干预，考察HJ11对缺血再灌注模型大鼠血清学指标及病理学的影响。 2.明确HJ11方改善大鼠缺血再灌注心肌损伤的可能作用机制，探索HJ11对铁死亡及免疫炎症反应的影响。 研究方法： 1.采用心动超声、ELISA检测血清学指标及组织染色观察HJ11对于I/R大鼠心肌损伤的改善作用。制备SD大鼠心脏缺血再灌注模型，心动通过超声的射血分数及室壁运动指标、心肌酶LDH、CK-MB作为模型评估指标，通过组织染色观察心肌形态结构改变、TTC观察心肌白色梗死面积、Tunel染色观察I/R大鼠心肌改变。 2.采用ELISA及流式分选检测炎症因子的表达、相关免疫细胞亚型的比例，以明确HJ11对于 I/R大鼠炎症反应的调节作用。利用ELISA检测I/R大鼠心脏组织匀浆中的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，通过流式细胞术检测大鼠血清中性粒、单核细胞各亚型的比例。 3.采用ELISA、组织染色、透射电镜及蛋白免疫印迹实验明确HJ11对于I/R大鼠铁死亡的干预作用。通过ELISA法检测大鼠血清及心脏组织中亚铁离子的表达;采用普鲁士蓝染色检测心脏组织中铁离子的沉积;通过透射电镜观察心肌组织中线粒体的结构改变，通过蛋白免疫印迹实验检测铁死亡相关蛋白的表达。 4.采用小干扰RNA技术及转染过表达质粒方法探索HJ11对于改善I/R大鼠心肌损伤的可能作用机制。制备H9c2缺血再灌注的细胞（OGCR）模型,通过转染小干扰RNA及过表达质粒干扰H9c2细胞中ACSL4的表达。通过ELISA观察细胞培养上清中炎症因子的表达，通过激光共聚焦观察转录因子NF-κB的核转移情况,通过蛋白免疫印迹法检测心肌细胞中TLR4/MyD88/NFκB及其下游信号分子的表达。 研究结果： 1.HJ11可改善I/R大鼠心肌损伤。心动超声可见I/R组左心室射血分数降低至30.67±5.55％,使用Aspirin、HJ11干预后可见射血分数增加，Aspirin组射血分数增加至47.77±10.28％,中、高剂量组较低剂量组改善效果更为明显，高剂量组射血分数增加至45.23±5.03％(p＜0.05),有效改善了大鼠心脏缺血再灌注后的心脏功能;心肌酶指标结果显示，I/R组较Sham组大鼠血清中LDH、CK-MB表达增加，使用HJ11干预后可降低大鼠缺血再灌注后LDH、CK-B的表达且同阳性对照药Aspirin组效果无异;TTC染色结果显示I/R组较假手术组的白色梗死面积增加，为43.74±27.19％(p＜0.05),Aspirin、HJ11干预后可见明显的白色梗死面积减少，其中HJ11-H组的效果最为明显，可见白色梗死面积减少至23.85±0.02％,说明HJ11可减少大鼠心肌缺血再灌注后造成的心肌梗死面积(p＜0.05);本部分结果表明模型制备成功且HJ11干预效果和Aspirin干预效果一致。HE结果可见HJ11可改善I/R大鼠的心肌组织结构改变并减少炎性细胞浸润;TUNEL染色结果显示I/R组较假手术组凋亡细胞明显增多，I/R组凋亡细胞阳性率高达53.86±6.78％,使用HJ11干预后可见凋亡细胞减少，HJ11-H组改善效果最为明显，阳性细胞率可降低至18.44±5.17％(P＜0.01),说明HJ11可减轻大鼠缺血再灌注后的心肌细胞凋亡。 2.HJ11可减轻I/R大鼠炎症反应。ELISA检测结果显示，I/R组各炎症因子较假手术组TNF-α、IL-6、IL-1β表达增加2-3倍，其中I/R组心脏组织TNF-α的表达高达99.11±5.53、IL-6为64.60±5.30、IL-1β为81.75±10.58,使用 HJ11干预可降低大鼠心肌组织匀浆中炎症因子的表达，且呈现剂量依赖性下调，HJ11-H组较I/R组炎症因子TNF-α的表达降低，TNF-α降低为56.19±16.58(P＜0.01)、IL-6为38.58±9.37、IL-1β为33.64±8.51(P＜0.01),说明 HJ11可有效降低各炎症因子的表达(P＜0.01);流式细胞术检测结果显示，HJ11对大鼠I/RI/R的中性粒细胞及单核细胞的调节呈现不同的趋势，I/R组较假手术组可见中性粒细胞表达增加(P＜0.01);单核细胞总比率表达降低，其中I/R组较假手术组的单核细胞促炎症亚型表达增加(P＜0.05)、抑炎症表型表达降低(P＜0.05)。ELISA及流式细胞分选结果说明HJ11对于大鼠心脏缺血再灌注后的炎症反应有很好的抑制作用;透视电镜观察心肌细胞细微结构，可见HJ11可改善大鼠心肌缺血再灌注损伤后的线粒体结构，减轻线粒体收缩、线粒体嵴断裂。 3.HJ11可干预I/R大鼠铁死亡。ROS结果示，I/R组较假手术组ROS表达增加，I/R组ROS表达可至145.3±5.86,是假手术组表达量47.00±4.00的3倍（P＜0.01),HJ11干预后可见ROS降低，HJ11-H组效果更为显著，可降低至102.70±5.69（P＜0.01）,说明HJ11可明显降低ROS的积累。MDA及SOD结果可见,HJ11可降低大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌组织中MDA的表达，增加大鼠心肌组织SOD及GSH的表达（P＜0.05）;ELISA检测大鼠血清及心肌组织中亚铁离子的表达，I/R组较假手术组呈现明显的增加，HJ11可呈剂量依赖性的抑制铁离子的沉积（P＜0.01）,普鲁士蓝染色结果也可见I/R组较正常组蓝染铁离子增加，HJ11干预后可见蓝染面积减少（P＜0.05）;Western blot检测大鼠心肌组织中铁死亡关键蛋白的表达，发现HJ11可下调ACSL4、COX2的表达，增加GPX4、FTH-1的蛋白表达。 4.HJ11对于改善I/R大鼠心肌损伤的可能作用机制。H9c2大鼠心肌细胞系重复体内研究的结果，发现HJ11可有效降低H9c2细胞OGD/R后的氧化应激损伤，并且可以呈现剂量依赖性的减少铁离子的沉积，活性氧的累积，提高H9c2细胞活力，改善OGD/R后的心肌损伤;ATP及mtDNA结果可说明，HJ11可以影响心肌细胞的能量代谢，增加ATP、mtDNA含量（P＜0.05）;透视电镜进一步观察H9c2细胞细微结构可见，HJ11也可改善OGD/R造成的线粒体的结构损伤，减轻线粒体收缩; Western blot结果可见HJ11可上调铁死亡关键蛋白GPX4、FTH-1的蛋白表达（P＜0.05）,降低ACSL4、COX2的表达（P＜0.05）,在心肌细胞OGD/R损伤中HJ11依然可发挥抑制铁死亡的作用;在OGD/R处理的H9c2细胞中ACSL4的敲除减轻了铁的积累、氧化应激和铁死亡;通过转染过表达ACSL4质粒逆转了 HJ11对OGD/R触发的铁沉积的抑制作用;增加了铁死亡诱导剂及抑制剂组，结果发现HJ11可发挥和铁死亡抑制剂效率相近的抑炎效果，并且观察加入铁死亡诱导剂组，炎症因子较HJ11组明显上调（P＜0.05）;共聚焦结果可见OGD/R组胞核内较胞浆内的NF-κB增加，使用HJ11干预后可逆转NF-κB入核增多的现象;蛋白免疫印迹实验结果可见OGD/R组较正常组TLR4、MyD88及TRAF6蛋白表达上调，胞浆内NF-κB减少，胞核内NF-κB增加，并且伴随P65的磷酸化增加（P＜0.05）,P-P65表达上调;IKBα表达未有明显变化，但是磷酸化的IKBα上调明显（P＜0.05）;使用HJ11干预后可见TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达较OGD/R组降低，胞浆内NF-κB增加,胞核内NF-κB降低，并且伴随P65的磷酸化减少（P＜0.05）,P-P65表达下调;IKBα表达未有明显变化，但是磷酸化的IKBα减少明显(P＜0.05）。加入铁死亡诱导剂Eartin后可逆转HJ11对上述蛋白表达的影响，而HJ11干预组和铁死亡抑制剂组Fer-1对于蛋白表达调控的作用基本相同，说明HJ11可发挥铁死亡抑制剂效果，通过降低转录因子NF-κB的激活、调节TLR4/MyD88/NFκB信号通路蛋白表达发挥减轻炎症反应的作用。 研究结论： 1 HJ11可减轻大鼠心肌缺血再灌注造成的心肌细胞病理损伤、改善缺血再灌注损伤后的心肌功能、减少心肌梗死面积的扩大，并降低心肌细胞凋亡; 2 HJ11可减轻心肌缺血再灌注后的炎症因子的释放，并降低中性粒细胞、单核细胞促炎症表型的比例，改善炎症反应带来的心肌损伤; 3 HJ11方减少I/R损伤后的铁离子沉积，减轻铁死亡，改善缺血再灌注造成的氧化应激损伤; 4 HJ11发挥铁死亡抑制剂的作用调控铁死亡关键蛋白ACSL4的表达干预铁死亡的发生发展，并且可以调节炎症反应关键信号通路TLR4/MyD88/NF-κB的表达变化，降低心肌细胞缺血再灌注损伤中的炎症因子的释放，降低炎症反应带来的心肌损伤，总之，HJ11可通过调节ACSL4介导的铁死亡及TLR4/MyD88/NF-κB抑制心肌 I/R损伤。
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