摘要
大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是一种重要的人畜共患病原体，也是原料乳中常见的食源性条件致病菌。由于抗菌药物广泛且大量使用，导致多重耐药现象已十分普遍。超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)主要在革兰氏阴性菌中产生，特别是大肠杆菌中，通过与青霉素结合蛋白结合而干扰细菌细胞壁的合成，导致细胞壁合成停滞，随后抑制生长，从而呈现高效、广谱的杀菌活性，被认为是对头孢菌素类抗生素产生耐药性的关键机制。本课题以分离自我国北疆三个地区(伊犁、石河子、乌鲁木齐)原料乳及牛场环境中产ESBLs大肠杆菌分离株为研究对象，对分离菌株耐药表型与基因型、ESBLs分型、毒力基因的携带情况、种系发育分型、生物被膜形成能力、脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field Gel Electrophoresis,PFGE)分型、全基因组结构特征进行系统分析，了解乳品生产链中产ESBLs大肠杆菌的污染状况及其遗传多样性，为有效控制大肠杆菌在北疆地区原料乳及牛场环境中的传播提供科学的理论依据。 在这项研究中，从来自北疆三个地区不同样本来源的570份原料乳样本和196份环境样本中分离出产ESBLs大肠杆菌共149株(19.5 ％,95％ CI:16.65 ％-22.25 ％),其中乌鲁木齐、石河子、伊犁的分离率分别为16.2％、22.4％和26.6％。根据样品来源看，养殖场环境样本和原料乳中的阳性分离率分别为39.3％和12.6％,其中环境中牛粪样品的阳性菌株分离率最高(65.8％),其次为污水（40.9％)、水槽(38.5％)和栅栏(27.3％)。 对分离自766份样品中的149株产ESBLs大肠杆菌分离株流行特征的监测结果表明，这些菌株流行的β-内酰胺酶主要以bla CTX-M-1、bla CTX-M-9和blaTEM为主,是北疆地区乳源性大肠杆菌对头孢类抗生素耐药的重要原因。采用微量琼脂稀释法对分离株进行13种抗生素的耐药表型检测。结果表明，149株大肠杆菌对不同种抗生素均表现出耐药现象，特别是对头孢噻肟、氨苄西林、哌拉西林、环丙沙星耐药率达到了 90％以上，但对亚胺培南和多粘菌素B敏感，耐药率分别为3.4％和4.7％。其中136株(91.3 ％,95 ％ CI:86.75 ％-95.80 ％)大肠杆菌对三种或三种以上的抗生素具有耐药性，为多重耐药菌株。此外，还对所有菌株的相关耐药基因型进行了评估，其中氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类耐药基因携带率较高。检测的149株ESBLs菌株只有36株属于肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC),可形成28种毒力基因谱。对分离株的生物被膜形成能力检测结果显示，有112株菌株可形成生物被膜，凸显了这些菌株的耐药和毒力潜力，并且在从不同样本来源分离的菌株之间未观察到显著差异。 分子分型检测使用了种系发育分型和脉冲场凝胶电泳分型两种不同的方法。种系发育分型结果主要是A组和B1组，说明所有菌株都为共生菌株。脉冲场凝胶电泳结果显示，49株典型分离菌株以80％相似性得到21个主要脉型(P1-P21)和28个亚型，表明菌株在分布区域和来源上存在整体的遗传多样性。采用高通量测序法对选取的环境源和原料乳中的1株ExPEC多重耐药分离菌株进行了全基因组测序分析，并使用生物信息学工具和数据库对其基因组结构、特有耐药基因和毒力基因特征等进行了预测和分析，其中ECU-R55基因组序列全长4494429bp,GC含量为50.92％,编码3678个蛋白，包含5种获得性耐药基因和24个毒力因子。实验结论为细菌致病机制研究奠定基础,对指导兽医临床合理使用抗菌药物提供理论依据，并且对于公共卫生安全等方面也有重要意义。
NETL