摘要
目的与意义：溃疡性结肠炎（Ulcerativecolitis，UC）是一种发病原因尚不明确，发作反复的慢性肠道疾病，严重影响患病动物正常生活。尤其是随着近年来生活方式的更迭，使UC的发病率不断上升。由于西医治疗存在免疫抑制和高复发性的局限性，寻找新的UC治疗药物已成为研究的热点。中草药因其低毒性、低残留、获取方便等特点，在临床上得到广泛应用。马齿苋和白头翁汤均被发现有很好的抗炎、抗氧化、免疫调节等作用，对UC具有一定的疗效，故本试验对其进行联合应用，通过网络药理学进行可能性分析，并从表征、组织病理学、分子生物学及肠道菌群变化等方面综合评估其疗效，以期为中药治疗UC提供参考。 研究方法：1、基于中药系统药理学分析平台筛选加味白头翁汤（SPD）的主要活性成分、作用靶点，根据疾病收纳数据库筛选UC主要靶点，取交集靶点即为SPD治疗UC的潜在靶点。应用Cytoscape软件构建成分-靶点-疾病互作关系网络并使用STRING构建蛋白互作频次，然后利用DAVID软件进行基因本体注释（GO）和信号通路（KEGG）富集分析，以初步筛选出加味白头翁汤调节UC的潜在靶点，为后续研究做准备。 2、根据前期预实验的结果，选用3.5%DSS建立UC模型，并选用柳氮磺胺吡啶（150mg/kg）为阳性药治疗组（T），设立低（L，4.37g/kg）、中（M，8.75g/kg）、高（H，17.29g/kg）三个剂量的SPD治疗组。通过体重变化、DAI评分、组织病理学等表征变化进行药物疗效的初步评估；采集结肠组织，通过荧光定量PCR（qPCR）检测炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-10基因表达，同时检测屏障相关蛋白occludin及MUC2的基因表达水平；使用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测结肠组织中促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白的表达，并检测血清中MDA、SOD、CAT和GSH含量的变化。 3、取结肠内容物进行16SrDNA测序分析，并从门水平及属水平上进行差异性分析，探究模型组及各治疗组治疗对小鼠肠道菌群变化影响，从菌群变化方面评估SPD缓解UC的潜在途径。 研究结果：1、本试验通过对中药活性成分筛选得出SPD中60种活性成分及411个药物靶点，与UC的975个靶点共有43个交集靶点。“成分-靶点-疾病”网络分析显示，SPD可能主要是通过槲皮素、木犀草素，作用于Alb、IL-6、TNF、Casp3、Egf、IL-10等关键靶点发挥调节作用。GO功能注释和KEGG富集分析结果显示，SPD主要通过TNF-α、MAPK及HIF-1信号通路发挥对UC的调控作用。 2、使用3.5%DSS造模成功建立UC模型，小鼠出现明显体重减轻，便血等症状。结果如下：（1）与模型组相比，中、高剂量SPD治疗组小鼠体重明显增加，疾病活动指数（DAI）明显降低、并显著缓解了DSS导致的结肠缩短的现象（plt;0.05）；（2）HE染色切片显示，与模型组相比，中、高剂量SPD治疗明显改善了DSS所造成的结肠组织损伤；（3）与模型组相比，中、高剂量SPD治疗显著降低了促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的mRNA水平（plt;0.05），同时增加了抗炎因子IL-10mRNA水平（plt;0.05），且高剂量SPD治疗组显著提高了结肠组织中屏障蛋白Occludin和MUC2的mRNA水平（plt;0.05）；（4）ELISA结果发现，与模型组相比，高剂量SPD治疗组结肠组织中促炎细胞因子TNF-α、IL-6蛋白的表达均显著性下调（plt;0.05），并一定程度下调了IL-1β的蛋白表达水平；（5）与模型组相比，不同剂量SPD治疗组血清中MDA含量均显著降低（plt;0.05），且高剂量SPD治疗组可显著升高血清中SOD、CAT、GSH含量（plt;0.05），改善机体抗氧化水平。 3、16SrRNA菌群测序结果表明：UC组小鼠菌群种类显著下降，菌群结构显著改变，且SPD治疗均能显著改善其水平（plt;0.05），使其趋于正常对照组水平。此外，通过门水平及属水平差异性分析发现，对照组Proteobacteria（变形菌门）丰度显著高于其它组；属水平优势菌群的筛选与分析共富集得到8个菌属分别为：拟杆菌属、副拟杆菌属、阿克曼菌属、乳杆菌属、毛螺旋菌属、螺杆菌属、狭义梭菌属和嗅杆菌属，其中拟杆菌属和副拟杆菌属在模型组的丰度明显高于其他组，提示其可能成为评估药物疗效的标志性微生物，表明加味白头翁汤可能通过调节肠道菌群调控UC。 结论：本研究从网络药理学分析了SPD对UC治疗的可行性，并成功建立UC模型，发现复方中药SPD治疗可通过抑制促炎性细胞因子的表达、增加屏障相关蛋白和抗氧化酶的水平，并调节肠道微生物菌群的组成，从而改善了UC小鼠的临床症状、疾病活动指数和溃疡性结肠炎造成的结肠的组织损伤。研究结果可为加味白头翁汤在兽医临床上的应用提供理论基础，同时为中药的配伍及新药的试用提供研究思路。
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