摘要
目的 采用高糖诱导(high-glucose-induced,HGI)的秀丽隐杆线虫衰老模型，探索柚皮苷的抗衰老作用及分子机制，为衰老及衰老相关疾病的防治提供理论依据。 方法 建立2％葡萄糖诱导的线虫衰老模型，同时加入不同浓度(25μM,50μM,100μM,200μM,500μM)的柚皮苷进行干预。根据寿命实验的结果筛选出柚皮苷用药的最佳浓度;在该浓度下检测与衰老相关的生理生化指标，包括:快速运动周期、身体弯曲频率、头部摆动频率、咽泵速率、体长体宽、子代数目、脂褐素、脂肪含量、线粒体膜电位等。然后进行全转录组测序，采用基因集变异分析(genesetvariationanalysis,GSVA)获取差异的通路。使用蛋白-蛋白作用(protein-proteininteraction,PPI)网络筛选出关键基因并用qPCR检测其表达量;基于竞争性内源RNA(competingendogenousRNAs,ceRNA)理论，使用miRanda,RNAhybrid以及RNA22三个软件预测柚皮苷延缓衰老的分子调控网络。使用荧光标记的线虫检测线虫体内自噬的水平。最后，使用突变株和RNAi线虫探索基因是否参与柚皮苷对HGI线虫的调控过程。数据处理、统计学分析以及可视化均使用R软件(4.2.0),检验水准α=0.05。 结果 1.柚皮苷可以改善HGI线虫衰老相关的生理生化指标:寿命实验确定25μM柚皮苷为最佳浓度。在此浓度下，与DMSO组相比，柚皮苷使HGI线虫的快速运动周期延长(P＜0.05)。在第5和第9d,相比与正常对照组，HGI线虫的身体弯曲频率和头部摆动频率下降(P＜0.05),而柚皮苷可以改善HGI线虫的这种衰退(P＜0.05)。在第9d,与正常对照相比，HGI线虫的咽泵速率升高(P＜0.05),而柚皮苷使HGI线虫的咽泵速率降低(P＜0.05)。此外，柚皮苷还改善HGI线虫生殖、体长、体宽等生理指标。对于生化指标，在第5和第9d,与DMSO组相比，柚皮苷使HGI线虫的肠道自发荧光减弱、体内脂肪含量下降、并改善线粒体膜电位损伤，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。 2.全转录组测序揭示柚皮苷延缓线虫衰老的分子机制:与DMSO组相比,柚皮苷处理的HGI线虫中有2603个差异表达的mRNA分子，2个差异表达的circRNA分子，4个差异表达的lncRNA分子以及32个差异表达的miRNA分子。使用GSVA获取DMSO和柚皮苷处理组之间差异有统计学意义的48条通路，并筛选出与脂肪生成和代谢相关的5条通路，以及与寿命和生殖发育相关的4条通路。对这些通路内的差异表达基因进行PPI网络分析,并筛选出关键基因。qPCR实验表明acs-2、acs-4、fat-7、ech-6等与脂肪生成和代谢相关的基因，以及与长寿和自噬相关的基因如yap-1、skn-1、hlh-30、lgg-1、unc-51和pha-4的表达量，在柚皮苷组和DMSO组的差异具有统计学意义（P＜0.05）。对这些基因以及差异表达的非编码RNA进行序列结合预测，结果表明circRNA-miRNA有11对，lncRNA-miRNA有8对，miRNA-mRNA有20对，最终构建circRNA/lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，提示柚皮苷通过ceRNA调控网络延缓HGI线虫衰老。此外，与DMSO对照相比，柚皮苷处理的HGIdFP∷LGG线虫的荧光增强，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 3.采用突变株和RNAi线虫，佐证柚皮苷在基因层面对HGI线虫衰老的调节作用:在降低skn-1和yap-1以及自噬相关基因hlh-30、lgg-1、unc-51和pha-4的表达量后，柚皮苷对HGI线虫的脂肪降低效应以及快速运动周期和寿命的延长作用消失。 结论 1.柚皮苷可以改善HGI线虫衰老相关的生理生化指标。 2.柚皮苷通过诱导自噬以及skn-1和yap-1介导的信号通路降低HGI线虫脂肪沉积，改善运动能力衰退，从而延缓衰老，提高寿命。 3.本研究初步揭示柚皮苷通过circRNA/lncRNA-miRNA-mRNA网络延缓HGI线虫衰老。
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