摘要
大口黑鲈弹状病毒（Micropterussalmoidesrhabdovirus，MSRV）引起的弹状病毒病对鲈鱼养殖产业造成严重危害。疫苗免疫作为抵御病毒性疾病的重要方法，能够有效预防养殖鱼类免受病毒侵袭。弹状病毒疫苗研究过程中，糖蛋白因包含丰富的抗原表位而备受关注，但MSRV糖蛋白发挥关键作用的抗原表位尚不明确。本研究以MSRV糖蛋白免疫后的大口黑鲈脾脏组织为基因信息来源，结合噬菌体展示技术构建抗体文库，通过生物淘选获得高亲和力抗体，并评价其抗MSRV活性。在此基础上，采用生物信息学技术对抗原-抗体互作位点进行分析，明确发挥关键作用的抗原表位，构建KLH偶联多肽疫苗并评价其免疫保护效果。研究结果如下： 1.抗MSRV噬菌体展示库的构建和生物淘选 通过注射方式免疫大口黑鲈，结合酶联免疫吸附技术检测血清抗体效价水平变化。利用分子生物学技术提取血清抗体效价峰值时的脾脏组织RNA并反转录为cDNA，通过PCR技术扩增抗体重链基因和轻链基因，结合噬菌体展示质粒pCantab5E构建抗MSRV噬菌体展示抗体库。采用固相筛淘法对抗体库进行生物淘选，结合phage-ELISA检测不同抗体亲和力。结果显示：MSRV糖蛋白（G2）免疫后，大口黑鲈血清抗体效价水平显著升高，第21d达到峰值（OD450=1.023）。琼脂糖凝胶电泳显示扩增出的抗体重链基因、轻链基因大小约为330bp，单链抗体基因大小约为700bp。平板计数法结果显示抗MSRV噬菌体展示抗体库库容量为2.16×105。经过4轮生物淘选，产出投入比逐轮增加，富集倍数为47。Phage-ELISA结果显示随机挑取的38个单克隆中有30个为阳性克隆，重组噬菌体的阳性率为78.95%。测序分析后共获得4株高亲和力抗体，分别命名为Ab-5、Ab-7、Ab-8和Ab-30。 2.重组抗体蛋白抗MSRV活性研究 通过原核表达技术分别构建抗体Ab-5、Ab-7、Ab-8和Ab-30的大肠杆菌表达菌株，结合SDS-PAGE和WesternBlot技术检测抗体蛋白表达情况。采用镍柱亲和层析、真空冷冻干燥等技术制备抗MSRV抗体蛋白。在此基础上，采用酶联免疫吸附法检测Ab-5、Ab-7、Ab-8和Ab-30对MSRV的亲和力，结合病毒感染和抗体治疗在细胞水平上评价4种抗体的抗MSRV活性。结果显示：Ab-5、Ab-7、Ab-8和Ab-30重组抗体蛋白大小分别为18kDa、45kDa、18kDa和18kDa。在相同摩尔浓度下，Ab-7抗体蛋白与MSRV的亲和力高于Ab-5、Ab-8和Ab-30。细胞安全性结果显示抗体Ab-7浓度低于300μg/mL对GCO细胞无显著毒性。与MSRV处理组相比，当抗体浓度为150μg/mL时，GCO细胞存活率显著提升至64.87%。抗体浓度为200、250和300μg/mL时，GCO细胞存活率分别为70.67%、71.68%和83.40%，MSRV病毒滴度显著降低。 3.糖蛋白抗原表位鉴定和多肽疫苗免疫效果研究 利用生物信息技术对抗原G2和抗体Ab-7蛋白的理化性质、亲疏水性进行分析。通过AlphaFold2模拟G2和Ab-7的蛋白质三维结构，利用分子对接技术分析抗原-抗体互作位点，分析鉴定G2蛋白发挥抗原作用的关键区域。在此基础上，通过化学合成法将鉴定得到的G2关键抗原表位ESQEFTTLTSH与KLH偶联构建多肽疫苗，采用腹腔注射方式免疫大口黑鲈，结合酶联免疫吸附法和病毒攻毒试验评价多肽疫苗免疫效果。结果显示：抗原G2和抗体Ab-7均为亲水性蛋白，二者分子对接结合能为-3.0kcal/mol。二维互作图显示抗原-抗体互作关键氨基酸集中于G210-20区域，其中G2Ser11和G2Gln12分别突变为丙氨酸后，抗原G2与抗体Ab-7分子对接结合能大于0。与对照组相比，多肽疫苗免疫后大口黑鲈血清抗体效价水平显著提高（p＜0.05），第21d血清抗体效价为1：25600。MSRV攻毒试验结果显示多肽疫苗的相对免疫保护率为62.07%。 综上所述，本研究基于噬菌体展示技术构建抗MSRV抗体库，筛选获得具有抗MSRV活性的高亲和力抗体。利用生物信息学技术分析得到短肽ESQEFTTLTSH是糖蛋白G2分段发挥抗原作用的关键表位，基于此短肽构建的KLH偶联多肽疫苗能有效诱导鱼体产生特异性免疫应答，具有良好的免疫保护效果。该项研究成果为水生动物病毒性疾病的抗原表位鉴定和疫苗开发提供了理论依据。
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