摘要
目的： 乳腺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是女性癌症死亡的主要原因。乳腺癌患者的预后较差且存在较大异质性，因此，寻找更加有效的治疗靶点和更加准确的预后评估方法具有重要意义。越来越多的证据表明，铁自噬通过铁死亡途径在多种人类疾病中发挥重要作用。然而，铁自噬相关基因在乳腺癌中的分子机制和预后作用尚不清楚。本研究通过筛选与乳腺癌患者预后相关的铁自噬基因并在此基础上建立乳腺癌患者的预后模型，进一步通过生存分析评估预后模型的预后价值，旨在更加有效的指导乳腺癌患者的精准诊疗，并提供一种有效的预后预测方法。 方法： 首先从癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）数据库下载乳腺癌患者的基因表达谱和临床信息，通过GeneCards数据库获得铁自噬相关基因。随后我们在乳腺癌样本与正常样本中使用R软件的DESeq2包对铁自噬相关基因表达量进行差异比较，最终筛选出表达显著差异的铁自噬相关基因，使用RIdeogram包展示其在人类基因组染色体中的位置。使用R软件中的clusterProfiler包进行GO注释分析和KEGG信号通路富集分析，以确定差异铁自噬基因的生物学功能和相关信号通路，使用STRING数据库构建了差异铁自噬基因的蛋白-蛋白互作网络，并通过Cytoscape软件进行可视化。将差异铁自噬基因纳入随机森林模型，进一步进行Cox回归分析，构建铁自噬相关基因的预后风险评分模型。根据多因素回归风险评分中位数将纳入模型患者分为高、低评分组。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析和Kaplan-Meier（K-M）分析来评估预后模型的预测效能，使用calibration校准分析和C指数评估预后模型的准确性，通过绘制临床特征联合风险评分的列线图来预测个体生存的概率，使用临床决策曲线（DCA）验证模型对临床患者受益的贡献。使用基因集富集分析（GSEA）对高低评分组进行基因集富集分析。使用CIBERSORT进行免疫浸润分析，使用miRwalk网站和ChEA3网站构建预后铁自噬基因调控网络。通过实时荧光聚合酶链反应（QuantitativeReal-timepolymerasechainreaction,qRT-PCR）检测核心关键预后基因在乳腺正常细胞及乳腺癌细胞中mRNA表达水平。结果利用R软件中的ggplot2包进行可视化。 结果： 从TCGA数据库共下载了1109例乳腺肿瘤样本和113例癌旁组织样本的基因表达谱数据，排除信息不全的数据，最终645例具有完整临床资料的乳腺癌患者被纳入本项研究。通过GeneCards数据库获得15个铁自噬相关基因。在乳腺癌样本与正常样本中对铁自噬相关基因表达量进行差异比较，最终获得9个表达显著差异的基因。进一步的功能富集分析显示，铁自噬相关基因在铁代谢相关过程和自噬相关功能中显著富集。将TCGA-BRCA乳腺癌肿瘤组织基因表达数据按照9：1的比例随机分为训练集（n=962）和验证集（n=107），提取前6个重要性较高的铁自噬相关基因（NCOA4,ELAVL1,FTH1,FBXW7,USP24和ATG16L1）纳入最终随机森林模型的构建。临床亚组生存分析表明，6个预后基因均与乳腺癌及其各亚组的生存时间有显著相关性。通过随机森林模型与临床参数进行Cox回归分析，构建预后风险评分模型来预测乳腺癌患者的预后。利用K-M曲线，时间依赖的ROC曲线和Cox回归分析来评估该模型的生存预测能力，K-M曲线显示，高危组患者往往预后较差，时间依赖的ROC曲线显示，该模型对于乳腺癌患者3年、5年、7年生存率预测AUC值分别为0.941、0.946、0.892。多因素Cox回归分析显示，风险评分为乳腺癌患者总生存期（OS）的独立危险因素。通过风险评分结合传统临床预后因素构建出一个列线图，显示结合多项指标能更好地预测肿瘤患者预后情况。构建了预后铁自噬基因-miRNA和预后铁自噬基因-TF间的调控关系网络，显示出预后铁自噬基因在机体内参与广泛的信号调控过程。此外，还对6种人乳腺癌细胞系和人正常乳腺上皮细胞系进行qRT-PCR检测，结果显示，相对于乳腺正常上皮细胞，ELAVL1和NCOA4基因在乳腺癌细胞系中高表达，FBXW7、FTH1、USP24和ATG16L基因在乳腺癌细胞系中低表达。 结论： 本研究通过筛选铁自噬相关差异基因，成功构建了一个新的基于6个铁自噬相关基因风险预后模型，并进一步验证了该预后模型在乳腺癌中具有良好的预测价值，这可能为临床乳腺癌的预后预测和治疗提供新的方向。
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