摘要
猪δ冠状病毒（Porcinedeltacoronavirus，PDCoV）和猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）均属于猪肠道致病性冠状病毒，可引起新生仔猪发生急性腹泻、呕吐、脱水甚至死亡，而且临床上这两种病毒混合感染的病例也较多，给临床诊断带来了一定的困难。芯片式数字PCR（ChipdigitalPCR，cd-PCR）是以特殊芯片为载体的油包水分割液滴的第三代PCR技术，具有更灵敏和更精准的特点，可应用于病毒感染的早期诊断。因此，本试验旨在利用cd-PCR建立一种高效、快捷的检测方法，不仅可以对PDCoV和PEDV实施精确定量的检测，还可以对PDCoV或PEDV形成的病毒气溶胶进行实时监测，为猪场病毒的净化和生物安全防控提供技术支撑。本试验的具体研究内容如下： 1.PDCoV和PEDV单重cd-PCR检测方法的建立及初步临床应用本试验根据GenBank中已发布PDCoV的N基因和PEDV的M基因序列分别设计PDCoV和PEDVcd-PCR检测方法的特异性引物与探针，构建阳性载体pMD18-T-PDCoV-N和pMD18-T-PEDV-M，通过反应条件优化后建立了PDCoV和PEDV单重cd-PCR检测方法，并对其特异性、灵敏性、重复性进行验证。试验结果表明：当PDCoV和PEDV单重cd-PCR检测方法的退火温度为58℃、引物与探针的浓度为800nM和1000nM时，阳性液滴与阴性液滴之间间距最大，且阳性液滴最集中，中间杂液滴数量最少。将所构建的标准质粒十倍比梯度稀释后，所建立的方法可检测到所稀释质粒的拷贝数分别为3.36copies/μL和2.12copies/μL，灵敏性较高；对猪常见的病毒如猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritisofswine，TGEV）、猪萨佩罗病毒（Porcinesapelovirus，PSV）和猪伪狂犬病毒（Porcinepseudorabiesvirus，PRV）的扩增结果均呈阴性，表明该方法的特异性良好；组内重复和组间重复的变异系数均小于7%，重复性良好。 将所建立的PDCoVcd-PCR方法对PDCoV感染仔猪的组织样品（心、肝、脾、肺、肾、颏下淋巴结、肠系膜淋巴结、脑、盲肠和空肠）进行检测。结果表明PDCoV在感染仔猪后，可广泛分布于所采集仔猪的各个脏器，与实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR，qPCR）结果一致。 使用本试验所建立的PEDVcd-PCR检测方法对20份猪腹泻病料进行检测，同时与qPCR和普通PCR进行平行试验。结果表明三种方法的PEDV阳性检出率分别为65%（13份）、50%（10份）和35%（7份），表明该检测方法灵敏性较高，对于临床早期诊断诊断有重要意义。 2.PDCoV和PEDV双重cd-PCR检测方法的建立及初步临床应用本试验根据GenBank中PDCoV的N基因和PEDV的M基因分别设计cd-PCR的特异性引物与探针，将含有FAM和HEX两种不同的报告基团探针混合后进行检测，实现对PDCoV和PEDV的绝对定量，同时进行特异性、灵敏性验证和方差分析。试验结果表明：当退火温度为58℃、混合的引物探针体系为5μL时，两个通道的阳性液滴与阴性液滴之间间距最大，且阳性液滴最集中，扩增效果最好；对猪常见的病毒如TGEV、PSV和PRV的扩增结果均呈阴性，特异性良好；把所构建的标准质粒十倍比梯度稀释后，经验证可检测到所稀释质粒的单拷贝，灵敏性较好；方差分析结果显著性均大于0.05，准确性强。 将所建立的双重cd-PCR方法对48份临床猪腹泻样本检测，并且与qPCR检测方法进行平行试验。结果表明两种方法的PDCoV阳性检出率分别为22.92%（11份）和12.5%（6份），PEDV阳性检出率分别为37.5%（18份）和14.58%（7份），混合感染检出率分别为10.42%（5份）和4.17%（2份），表明所建立的双重cd-PCR检测方法不仅可以应用于PDCoV或PEDV的单独感染病例检测，还可以对混合感染的病例进行定量分析。 3.PDCoV和PEDV气溶胶研究模型的构建和初步临床应用为了构建PDCoV和PEDV气溶胶研究模型，首先用塑料膜搭建一个1m3的密闭空间。将PDCoV（4.25×106copies/mL）和PEDV（7.6×106copies/mL）病毒液各1mL混合后分别进行10、100和1000倍稀释，使用气溶胶发生装置分别发射病毒混合液（持续6min），采集空气中的病毒粒子并且富集处理，使用PDCoV和PEDV双重cd-PCR检测方法计算富集液中的病毒拷贝数并进行分析。结果表明，所构建气溶胶研究模型可成功采集到PDCoV（2352copies/m3、5103copies/m3、15309copies/m3）和PEDV（1008copies/m3、19341copies/m3、99603copies/m3）病毒粒子。 为了探究在PDCoV感染仔猪周围病毒气溶胶的产生与分布情况，选取3头5日龄健康仔猪，进行PDCoV感染试验（口服攻毒滴度为1×108TCID50/，10mL/头），分别在攻毒后24和72h按距离仔猪0、2和4m使用气溶胶采集器采集空气样本进行cd-PCR检测。结果表明PDCoV病毒粒子含量在距离攻毒仔猪上方（0m）时含量最多（24h为5218copies/μL，72h为5870copies/μL），距离2m时其含量逐渐减少（24h为338copies/μL，72h为1239copies/μL），距离仔猪4m时较低（24h为7copies/μL，72h为9copies/μL）。 本试验成功建立PDCoV和PEDV的单重和双重cd-PCR检测方法，为临床检测PDCoV和PEDV提供了一种快捷、准确和高效率的新方法。同时成功构建了PDCoV和PEDV气溶胶研究模型，并应用所建立的cd-PCR检测方法对其进行分析，发现PDCoV和PEDV可以在空气中形成病毒气溶胶，对深入探究其传播机制提供了新的研究模型。
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