单倍体育种是作物品种选育中常用的方法，而小孢子培养技术是获得单倍体的主要途径。通过小孢子培养技术，能够在短时间内快速获得大量单倍体，单倍体加倍即可获得基因型纯合的双倍体植株，从而加快育种进程。但小孢子培养技术容易受到材料的基因型、预处理方式、分离与纯化方式、培养基种类及成分等多种影响因素的限制，严重阻碍了小孢子培养技术在实际育种中的应用。 油菜属于十字花科双子叶植物，是主要的油料作物；小麦属于禾本科单子叶植物，是主要的粮食作物。本研究以甘蓝型油菜和普通小麦小孢子为外植体，通过对小孢子培养中关键影响因素的研究，以期建立和优化甘蓝型油菜和普通小麦小孢子分离、培养及再生体系，进而探索小孢子培养技术在作物遗传群体构建及单倍体快速育种中的应用途径。本研究主要结果如下： 1.研究了材料消毒方式、取材花蕾大小、活性炭和琼脂浓度等因素对油菜小孢子培养的影响，进一步优化了油菜小孢子培养及分化体系，结果表明：使用75%酒精30s+3%次氯酸钠溶液的消毒方式，可以显著提高小孢子来源花蕾的消毒效果，降低培养基污染率；确定了以花蕾大小作为不同基因型油菜最佳取材时期的判定依据，当DH20FB2759/HY62、DH19YB437/FC111、DH19YB437/18JHB161三种基因型的花蕾大小分别为3.7±0.3mm、3.0±0.3mm、3.7±0.3mm，对应的小孢子发育时期为单核靠边期至双核早期，此时为小孢子培养的最佳取材时期，小孢子胚诱导率最高，分别为17.47胚/蕾、14.55胚/蕾、14.91胚/蕾；0.1%活性炭可以提高后续胚状体的质量，促进胚状体发育成苗；0.9%-1%的琼脂浓度可以显著提高绿苗率，最大绿苗率可达86.67%，有利于获得健壮的再生植株。 2.建立了完善的油菜小孢子分离、培养及分化体系，包括：（1）小孢子分离体系：取大小为3.0-3.7mm左右的花蕾40个左右→75%酒精30s+3%次氯酸钠溶液+2滴表面活性剂的消毒→在B5液体培养基中采用玻璃棒研磨法和离心法分离纯化小孢子；（2）小孢子培养体系：1×106个细胞/ml的小孢子→含有50mg/L秋水仙碱的N13培养基（NLN培养基+13%蔗糖）→32℃热激2天→洗脱秋水仙碱→N13培养基中静置培养2-3周→50rpm摇床弱光培养2周左右，出现可见胚状体，胚状体诱导率最高可达17.47胚/蕾；（3）胚状体分化体系：胚状体→接种至B5固体培养基中培养40-50天→移栽春化，绿苗率最高可达86.67%。 3.研究了消毒方式、预处理方法、取材时期及分离纯化方法对小麦小孢子培养的影响，结果表明：75%酒精擦拭麦穗+2%次氯酸钠溶液消毒10min的消毒方式，能够达到良好的消毒效果，降低培养基污染率；高温热激预处理能够提高细胞膨大的比率，0.5g/L的硫酸铜溶液预处理14天可显著提高小孢子诱导率，使小孢子诱导率达到3.5胚/穗；确定了以麦穗外部形态作为不同小麦品种，小孢子最佳取材时期的依据。当西农979、轮选987的穗子外部形态分别为阶段2（麦穗顶部距旗叶叶鞘1cm，且麦芒刚露出），科农199材料为阶段3（麦芒完全露出，但穗子未从苞叶中露出）时，单核靠边期小孢子比率最多，分别达到63.11%、56.78%、58.71%；玻璃棒研磨法可以有效地从花药中分离小孢子，使用0.3mol/L的甘露醇+1g/LMES+1.1g/LCaCl2·2H2O的小孢子提取液可以获得的生活状态最佳的小孢子，其细胞完整度可达91.99%，细胞活力可达79.02%；小孢子的最佳纯化方法为小孢子提取液+21%麦芽糖溶液的梯度离心法得到较高比率的单核靠边期小孢子，其比率可达80.71%。 4.建立了小麦小孢子分离、纯化及培养体系，包括：（1）小孢子分离及纯化体系：外部形态为阶段2至阶段3的麦穗于0.5g/L的硫酸铜溶液中4℃低温处理14天→75%酒精擦+2%次氯酸钠消毒10min→0.3mol/L的甘露醇+1g/LMES+1.1g/LCaCl2·2H2O小孢子提取液+玻璃棒研磨法分离小孢子→小孢子提取液+21%麦芽糖密度梯度离心法纯化小孢子；（2）小孢子培养体系：1×104个细胞/ml的小孢子→NPB99液体培养基静置培养40天左右出现胚状体。 本研究通过油菜和小麦小孢子分离、培养及再生体系的建立和优化，为探索小孢子培养技术在作物遗传群体构建及单倍体育种应用奠定了方法基础。
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