摘要
背景和目的 急性肺损伤（ALI）及其更严重的形式急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是ICU脓毒症患者常见的并发症，具有较高的发生率和病死率，且潜在发病机制及病理生理机制尚不明确。研究表明，严重的炎症反应是ALI/ARDS发生和进展的主要病理生理机制。肺泡巨噬细胞（AM）最先对肺部炎症作出反应，是抵御病原体入侵的第一道防线。细胞焦亡是一种与炎症相关的程序性细胞死亡，它的特征是可以释放大量炎症因子，最终引起强烈的炎症反应。AM焦亡在脓毒症肺损伤的进展中起着重要的作用。既往有研究发现，激活转录因子3（ATF3）在ALI中发挥保护作用，但作用机制尚未阐明。因此，本研究通过体内外实验探究ATF3的表达水平，并建立脂多糖（LPS）联合三磷酸腺苷（ATP）诱导的小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S）焦亡模型，探究ATF3调控细胞焦亡的机制，为保护ALI提供实验基础和理论依据。 方法 1.ALI体内模型的构建及ATF3的表达差异 采用C57BL/6小鼠作为体内模型，随机分为两组：对照组和LPS组。对照组给予气管内滴注生理盐水，LPS组给予气管内滴注LPS（5mg/kg），构建ALI模型。24h后处死小鼠并收集眼球血及肺组织。HE染色观察肺组织形态学变化，并做出肺损伤病理评分。计算肺组织湿/干重（W/D）比值。ELISA及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测血清以及肺组织中炎症因子IL-1β、IL-18的水平。应用蛋白免疫印迹法（WB）、RT-qPCR、免疫组化技术检测肺组织中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1、Caspase-11、焦孔素D（GSDMD）、IL-1β、IL-18水平。透射电镜观察肺组织超微结构。应用WB、RT-qPCR、免疫荧光技术检测肺组织中激活转录因子3（ATF3）的表达与定位。 2.ALI体外模型的构建及ATF3的表达差异 对MH-S进行实验分组：（1）对照组：正常培养。（2）LPS＋ATP组：采用不同浓度的LPS（0、50、100、200、500和1000μg/L）刺激分别6h、12h、24h后，继续采用不同浓度的ATP（0.5、2、5mM）刺激0.5h建立体外ALI模型。采用细胞计数试剂盒（CCK）-8测定细胞活力；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒测定细胞培养上清中LDH释放情况；Hoechst33342/PI染色检测MH-S的损伤情况；光镜及透射电镜观察细胞形态及膜完整性；WB、RT-qPCR检测MH-S中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-18水平，ELISA检测细胞培养上清中炎症因子IL-1β、IL-18的水平，WB、RT-qPCR、免疫荧光技术检测MH-S中ATF3的定位与表达。 3.ATF3对ALI体外模型的影响 利用转染试剂瞬时转染小干扰RNA（si-RNA），构建敲低ATF3表达的MH-S，RT-qPCR、WB验证ATF3敲低。将转染后的细胞分为四组：阴性对照（NC）-siRNA组、ATF3-siRNA组、NC-siRNA＋LPS＋ATP组、ATF3-siRNA＋LPS＋ATP组。通过检测CCK-8和LDH释放，分析ATF3对LPS＋ATP诱导的MH-S的存活率及损伤的影响。WB、RT-qPCR、免疫荧光技术检测ATF3对MH-S焦亡相关分子NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18表达水平的影响。ELISA评估各组细胞培养上清中IL-1β、IL-18的水平。 结果 1.ALI体内模型的成功构建且ATF3呈高表达状态 HE染色显示LPS组小鼠肺泡完整性破坏，肺泡腔及肺泡间隔内有大量炎症细胞浸润，肺病理损伤评分显著升高。LPS组小鼠肺组织W/D比值显著升高。ELISA及RT-qPCR检测显示LPS组小鼠血清以及肺组织中炎症因子IL-1β、IL-18的水平显著升高。WB、RT-qPCR、免疫组化技术检测显示LPS组小鼠肺组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18水平显著升高。透射电镜观察肺组织超微结构发现LPS组小鼠细胞出现细胞膜完整性破坏、细胞内空泡增多、染色质聚集、线粒体肿胀等细胞焦亡的特征。WB和RT-qPCR结果显示，LPS组小鼠肺组织ATF3蛋白的表达显著增加。免疫荧光结果显示，LPS组小鼠肺组织ATF3表达增加，且主要定位于细胞核。 2.ALI体外模型的成功构建且ATF3呈高表达状态 CCK-8测定细胞活力，确定最适条件为100μg/L浓度的LPS诱导6h加用0.5mM浓度的ATP诱导0.5h。LDH检测显示LPS＋ATP组LDH释放增加。Hoechst33342/PI染色显示LPS＋ATP组细胞的损伤增多。光镜及透射电镜显示LPS＋ATP组细胞形态及膜完整性破坏。WB、RT-qPCR检测LPS＋ATP组MH-S中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-18水平显著升高。ELISA检测LPS＋ATP组细胞培养上清中炎症因子IL-1β、IL-18的水平显著升高。WB和RT-qPCR结果显示，LPS＋ATP组ATF3蛋白的表达与时间密切相关，并于6h达到最高峰。免疫荧光结果显示，LPS＋ATP组ATF3表达增加，且主要定位于细胞核。 3.ATF3对ALI体外模型的影响 CCK-8和LDH释放显示，ATF3对LPS＋ATP诱导的MH-S具有保护作用。WB、RT-qPCR、免疫荧光技术检测敲低ATF3后MH-S内经典及非经典焦亡通路相关分子NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18表达水平显著升高。ELISA显示各组细胞培养上清中IL-1β、IL-18的水平显著升高。 结论 1.LPS可以诱导小鼠ALI体内模型，且激活细胞焦亡信号通路，ATF3在小鼠ALI中呈现高表达。 2.LPS联合ATP可以诱导ALI体外模型，且激活细胞焦亡信号通路，ATF3在ALI体外模型中呈现高表达。 3.ATF3对LPS＋ATP诱导的体外ALI模型具有保护作用，其机制可能与下调细胞焦亡经典通路NLRP3、Caspase-1、GSDMD的蛋白表达以及细胞焦亡非经典通路Caspase-11的蛋白表达有关。
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