摘要
第一部分：体外实验比较由FP、IL-4以及IFNγ联合LPS诱导的极化巨噬细胞对IL-1β诱导的软骨细胞退变的影响 目的：骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是最常见的关节退行性疾病。滑膜巨噬细胞被认为参与了OA的病情进展。基于巨噬细胞所受刺激、转录和分泌特征的不同，巨噬细胞通常被分为不同的极化类型。然而目前尚无研究比较分别由脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）联合干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白细胞介素(Interleukin,IL)-4、糖皮质激素（Glucocorticoid,GC）诱导而来的三种极化巨噬细胞通过旁分泌对退变关节软骨细胞的影响。因此本部分研究将通过体外实验比较由IFNγ+LPS、IL-4、丙酸氟替卡松(Fluticasonepropionate，FP，一种GC)诱导而来的三种极化巨噬细胞通过旁分泌对白介素-1β诱导的软骨细胞退变的影响。 方法：（1）采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化法提取小鼠关节软骨细胞，并通过甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫荧光染色对所提取的原代软骨细胞进行鉴定。（2）分别用IFNγ+LPS、IL-4、FP来诱导J774A.1巨噬细胞极化，由此得到的三种极化巨噬细胞（Macrophage，M）分别表示为：M（IFNγ+LPS）、M（IL-4）、M（FP）；收集三种极化巨噬细胞条件培养基(MacrophageConditionedMedium,MCM)，采用ELISA试剂盒检测MCM中IL-6、CCL17和CXCL13的浓度,以验证极化诱导成功与否。（3）为了模拟OA患者的软骨细胞退变状态，用10ng/ml的IL-1β预处理软骨细胞24小时，以此模拟软骨细胞退变。（4）为了比较三种极化巨噬细胞通过旁分泌对退变软骨细胞活性的影响，分别用各组MCM培养退变软骨细胞，采用CCK8试剂盒检测MCM对退变软骨细胞活性的影响。（5）为了比较三种极化巨噬细胞通过旁分泌对退变软骨细胞增殖、调亡、合成代谢和炎症分解代谢的影响，采用Transwell共培养形式来实现退变软骨细胞分别与三种极化巨噬细胞的共培养；而后分别采用EdU染色试剂盒、AnnexinV-APC/7-AAD细胞调亡试剂盒（流式细胞术）比较各共培养组中软骨细胞的增殖、调亡情况；采用WesternBlot法比较各共培养组中软骨细胞Aggrecan、CollagenⅡ、SOX9、MMP13、MMP9、ADAMTs5的蛋白表达情况。 结果：（1）胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化法获得了大量高纯度的软骨细胞。（2）经IFNγ+LPS、IL-4、FP处理分别成功诱导了J774A.1巨噬细胞向M（IFNγ+LPS）、M（IL-4）、M（FP）极化。（3）与正常软骨细胞相比，10ng/ml的IL-1β处理降低了软骨细胞的活性、增殖能力，并抑制了Aggrecan、CollagenⅡ、SOX9蛋白表达，同时加重了细胞调亡，并促进了MMP13、MMP9、ADAMTs5蛋白的表达。（4）与IL-1β处理组相比，与M（IFNγ+LPS）的共培养（或MCM）降低了退变软骨细胞的活性、增殖能力，并抑制了Aggrecan、CollagenⅡ、SOX9蛋白表达水平，同时加重了细胞的调亡，并促进了MMP13、MMP9、ADAMTs5蛋白的表达。而与M（IL-4）和M（FP）的共培养（或MCM）则提高了退变软骨细胞的活性、增殖能力，并促进了Aggrecan、CollagenⅡ、SOX9蛋白的表达，同时减少了退变软骨细胞的调亡，并抑制了MMP13、MMP9、ADAMTs5的蛋白表达。但在M（IL-4）共培养（或MCM）组和M（FP）共培养（或MCM）组之间，各项检测结果无显著差异。 结论：促炎性M（IFNγ+LPS）通过旁分泌作用会显著加重IL-1β诱导的退变软骨细胞的调亡和炎症状态，并抑制其细胞活性、增殖能力和合成代谢水平，从而进一步加重IL-1β诱导的软骨细胞退变；而抗炎性M（IL-4）、M（FP）通过旁分泌作用会显著抑制IL-1β诱导的退变软骨细胞的调亡和炎症状态，并增强其细胞活性、增殖能力和合成代谢水平，从而发挥对IL-1β诱导的软骨细胞退变的保护作用。此外，这种对退变软骨细胞的旁分泌保护作用在M（IL-4）及M（FP）之间没有显著差异。这些结果为滑膜巨噬细胞极化通过旁分泌作用影响软骨细胞退变状态提供了新的见解。 第二部分：体外实验探究Mer受体酪氨酸激酶介导的巨噬细胞胞葬作用对IL-1β诱导的软骨细胞退变的影响 目的：调亡细胞被以巨噬细胞为主的吞噬细胞清除的过程称为胞葬作用（Efferocytosis）。经糖皮激激素诱导极化的巨噬细胞高表达Mer受体酪氨酸激酶(MerReceptorTyrosineKinase,MerTK)，并在MerTK的介导下可发生胞葬作用。而胞葬作用被证实在清除调亡细胞的同时可以增强巨噬细胞的炎症抑制能力。然而MerTK介导的巨噬细胞胞葬作用对退变软骨细胞的影响尚不清楚。因此本部分研究的目的是通过体外实验探究MerTK介导的巨噬细胞胞葬作用通过旁分泌对IL-1β诱导的软骨细胞退变的影响。 方法：（1）采用WesternBlot法检测M（IFNγ+LPS）、M（IL-4）、M（FP）的MerTK蛋白表达水平。（2）采用紫外线照射法诱导EL-4-B5细胞凋亡，用Annexin-APC／7-AAD细胞调亡检测试剂盒确定调亡率。（3）采用免疫荧光技术检测M（FP）的胞葬作用以及MerTK抑制剂UNC2250对M（FP）胞葬作用的抑制：胞葬作用抑制组的巨噬细胞M（FP）用UNC2250预处理以抑制MerTK，而胞葬作用组的巨噬细胞M（FP）不进行UNC2250预处理；随后诱导EL-4-B5细胞调亡，并用CFDA标记，并使之与经过或未经过UNC2250处理的M（FP）共培养2小时，洗涤后用CY3-F4/80标记经过共培养后的M（FP），用荧光显微镜检测M（FP）中CY3和CFDA的双阳性情况(表明巨噬细胞发生了胞葬作用）。（4）设立M（FP）组、胞葬作用组和胞葬作用被抑制组：其中M（FP）组的M（FP）巨噬细胞作为对照，既未经UNC2250预处理，也未与凋亡的EL-4-B5细胞共培养；胞葬作用组的M（FP）未经UNC2250预处理，但与凋亡的EL-4-B5细胞进行共培养，以诱导胞葬作用的发生；胞葬作用被抑制组的M（FP）先经UNC2250预处理以抑制MerTK，后与凋亡的EL-4-B5细胞进行共培养。（5）分别收集三个组的MCM，用MCM培养退变软骨细胞，采用CCK8试剂盒检测各组MCM对退变软骨细胞活性的影响。（6）采用Transwell共培养模型来实现退变软骨细胞分别与对照组M（FP）、胞葬作用组M（FP）和胞葬作用被抑制组M（FP）的共培养；采用EdU染色试剂盒检测共培养模型中软骨细胞的增殖情况；采用Annexin-APC／7-AAD细胞调亡检测试剂盒（流式细胞术）检测共培养模型中软骨细胞调亡情况；采用WesternBlot法检测共培养模型中软骨细胞Aggrecan、CollagenⅡ、SOX9、MMP13、MMP9、ADAMTs5的蛋白表达情况。 结果：（1）WesternBlot结果显示：MerTK蛋白在M（FP）中显著高表达，而在M（IFNγ+LPS）和M（IL-4）中表达极低。（2）紫外线照射法成功诱导了EL-4-B5细胞的凋亡，早期调亡细胞（APC+,7AAD-）率为74.36±3.09%，可用于后续实验。（3）成功诱导M（FP）发生胞葬作用，这一作用可被MerTK抑制剂UNC2250显著抑制。（4）相比于未发生胞葬作用的对照组M（FP），发生胞葬作用后的M（FP）在共培养（或MCM）的条件下可进一步提高退变软骨细胞的细胞活性、增殖能力，并促进Aggrecan、CollagenⅡ、SOX9蛋白的表达，同时减少退变软骨细胞的调亡，并抑制MMP13、MMP9、ADAMTs5的蛋白表达，提示M（FP）在发生胞葬作用后对退变软骨细胞的旁分泌保护作用得到加强。此外，这种加强的旁分泌保护作用可被MerTK抑制剂UNC2250抑制胞葬作用的同时部分（而非完全）逆转，提示这种加强的旁分泌保护作用至少在一定程度上是由MerTK介导的。 结论：我们通过体外共培养模型（或MCM）比较了未发生胞葬作用的对照组M（FP）、胞葬作用组M（FP）和胞葬作用被MerTK抑制剂UNC2250抑制组M（FP）通过旁分泌对软骨细胞退变的影响，结果表明M（FP）在发生胞葬作用后显著增强了其对退变软骨细胞的旁分泌保护作用，并且这种加强的旁分泌保护作用至少在一定程度上是由MerTK介导的。因此，靶向MerTK介导的M（FP）的胞葬作用可能是骨性关节炎的潜在治疗方法。
NETL