摘要
【研究背景】 登革病毒（Denguevirus，DENV）是一种经蚊媒传播致病的病原体，每年造成约3亿新感染者，病死率约为5%，但针对其感染目前尚无特效药可用，因此DENV疫苗的研发成为该领域的热点。寨卡病毒（Zikavirus，ZIKV）与DENV同属黄病毒科病毒，它们在EDIII蛋白结构上具有相似性，容易诱导机体产生交叉保护的免疫应答。近年来结构蛋白E中的EDIII（EnvelopeproteindomainIII）已被确定为可诱导高度中和特性保护抗体的主要靶点，成为构建疫苗的基础。 目前研究相对成功的DENV疫苗为减毒活疫苗，但该类疫苗存在毒力回复风险，且易引发抗体依赖性增强（Antibodydependentenhancement，ADE）效应。与传统疫苗相比，DENV多价核酸疫苗的研发相对滞后，但核酸疫苗具有良好免疫原性、无需佐剂、研发周期较短等优点，已成为当前疫苗研究领域的重要方向。核酸疫苗是新兴的疫苗技术，包括DNA疫苗与mRNA疫苗；DNA疫苗具有成本低、递送简单的优点，mRNA疫苗则具有更高的安全性。mRNA疫苗的递送系统与非编码区序列的优化可以提升mRNA翻译效率及稳定性，有助于激发更高水平的体液免疫和细胞免疫。因此构建以EDIII为靶标抗原的多价核酸疫苗为开发安全有效的DENV多价疫苗奠定了理论基础。 【研究目的】 1.目前DENV核酸疫苗主要由四个单价或两个双价疫苗混合配伍而成，引起的体液免疫水平低、保护效力弱、免疫应答不均衡。本研究基于核酸疫苗技术体系，以构建成本较低、递送方式简单的DNA疫苗为研发DENV核酸疫苗的切入点，将4种血清型DENV结构蛋白E中EDIII作为靶标抗原，构建可引起针对4种血清型DENV均衡性免疫效应的单一序列多价DNA疫苗。使用电脉冲方式将DNA疫苗递送至肌肉组织，以此验证串联抗原的有效性，以期获得均衡的免疫应答。 2.由于mRNA疫苗有更高的安全性，并且目前单一序列DENV多价mRNA疫苗研究滞后，本研究进一步以DNA疫苗验证的抗原为靶标抗原，加入黄病毒共有TBT表位，拟通过脂质纳米颗粒（LipidNanoParticle，LNP）递送系统以及序列优化，研发出更为安全、具有更高免疫效应的DENV多价mRNA疫苗。 【研究方法】 1.DENV多价DNA疫苗的构建与疫苗有效性验证 基于根据NCBI上公布的DENV的序列，筛选4种血清型DENVEDIII区域，用G4S3柔性肽将4种血清型DENV的EDIII区域串联，将片段构建至pVAX1表达载体上作为DNA疫苗备用。通过免疫细胞荧光检测质粒转染后DC2.4细胞中目的蛋白表达；在小鼠模型中，通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）检测特异性抗体IgG水平，通过酶联免疫斑点检测试验（Enzyme-linkedImmunospotAssay，ELISPOT）检测IFN-γ、IL-4水平；在致死量病毒攻击乳鼠模型中检测小鼠免疫后血清保护效力。 2.DENV多价mRNA疫苗构建与疫苗有效性验证 （1）确定最优LNP递送系统 通过mRNA体外转录与纯化获得eGFPmRNA。分别用含有DLin-MC3-DMA、SM-102两种可电离脂质的不同N/P配方递送系统包装eGFPmRNA，通过Quant-iTRiboGreenRNAAssayKit试剂盒检测mRNA-LNP包封率，利用DLS激光粒度分析仪比较各mRNA-LNP的粒径大小、分散系数、ZETA电位、粒子数目，筛选出最优递送体系。 （2）筛选优势非编码区UTR和信号肽实现mRNA疫苗序列优化 构建含R27或ZK非编码区（Untranslatedregion，UTR）的两种eGFPmRNA转录模板序列，通过mRNA体外转录与纯化获得目的mRNA。通过显微镜观察Vero细胞转染mRNA后各组荧光表达情况，筛选出优势UTR。 以高斯荧光素酶（GaussiaLuminescence，Gluc）为模式编码蛋白，构建含TPA或IgE两种信号肽的GlucmRNA转录模板，通过mRNA体外转录与纯化获得目的mRNA。利用Secrete-Pair?GaussiaLuciferaseAssayKit试剂盒检测转染mRNA后的细胞上清Gluc蛋白与肌注给药后各时间点小鼠全血Gluc蛋白表达情况，筛选优势信号肽。 （3）DENV多价mRNA疫苗构建与免疫效应评价 利用DNA疫苗设计的4种血清型串联型抗原序列、搭载黄病毒共有TBT表位和优势UTR与信号肽，构建单一序列的DENV多价mRNA疫苗，利用最优LNP进行mRNA递送。通过免疫细胞荧光检测mRNA在细胞中的蛋白表达；在小鼠模型中，通过ELISA检测特异性抗体IgG水平，ELISPOT检测IFN-γ、IL-4水平；在致死量病毒攻击乳鼠模型中检测小鼠免疫后血清保护效力。 【研究结果】 （1）本研究构建的一种串联4种血清型DENVEDIII的DNA疫苗可在细胞水平有效表达，并且可以成功激发小鼠体内产生针对4种血清型DENV的特异性体液免疫、细胞免疫；免疫后血清能保护乳鼠免受4种血清型DENV致死性感染，对ZIKV致死性感染有部分保护作用。 （2）DLin-MC3-DMA配方中N/P为3:1的递送系统的稳定性、所含粒子数量均优于其余配方；相较DLin-MC3-DMA的N/P3:1递送系统，SM-102的N/P6:1配方在各项表征数据表现更佳，因此最终筛选出SM-102的N/P6:1（LNP6:1）为最优mRNA疫苗递送体系。 （3）研究结果表明eGFP-R27mRNA在转染Vero细胞后表达荧光强度最高、持续性最好，筛选出R27为优势UTR；TPA-GlucmRNA在转染DC2.4细胞上清与给药小鼠全血中表达的蛋白含量最高，因此筛选出TPA为优势信号肽。 （4）经序列优化后的DENVmRNA疫苗可在细胞水平有效表达抗原蛋白，并且可以成功激发小鼠体内产生优于DNA疫苗的针对4种血清型DENV与黄病毒共有TBT表位的特异性体液免疫与Th1偏向的细胞免疫；免疫后血清能保护乳鼠免受4种血清型DENV致死性感染，mRNA疫苗免疫后血清对ZIKV致死性感染的保护作用优于DNA疫苗。 【研究结论】 （1）本研究构建了以4种血清型DENVEDIII为抗原的DENV多价DNA疫苗，该疫苗能成功激发小鼠产生体液免疫和细胞免疫效应。 （2）本研究筛选出SM-102的LNP6:1为mRNA疫苗的最优递送系统。 （3）本研究筛选出R27为优势UTR，TPA为优势信号肽。 （4）本研究构建了以4种血清型DENVEDIII与TBT为抗原的DENV多价mRNA疫苗，其中抗原序列搭载优势UTR与信号肽，获得序列优化的mRNA疫苗。该疫苗能成功激发小鼠产生优于DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫效应。 【研究意义】 本研究基于核酸疫苗技术体系，设计了一种单一序列、串联型DENV多价DNA疫苗，验证了DNA疫苗可激发小鼠产生针对DENV的特异性免疫，体现了串联型DENVEDIII抗原序列的有效性，为DENV多价mRNA疫苗的研究奠定了坚实的理论基础。通过优化mRNA疫苗的UTR、信号肽、递送系统获得的DENV多价mRNA疫苗，可以有效激活小鼠体内产生针对DENVEDIII与黄病毒共有TBT表位的免疫应答，发挥免疫保护作用，为DENV多价疫苗和黄病毒广谱疫苗的后续研发提供了理论依据和研究基础。
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