摘要
目的：为了解过量中药活性成分鞣花酸对正常肾小管上皮细胞的细胞毒性及线粒体功能的影响，以期为鞣花酸用于治疗糖尿病肾病研究的用药安全性提供一定的理论依据，进行以下相关实验。 方法：（1）以不同浓度0，50，100，150，200μM鞣花酸，不同时间24h，48h干预体外培养肾小管上皮细胞（HK-2细胞）以建立肾小管上皮细胞损伤模型，在分别干预24h，48h后，用CCK-8试剂检测各组细胞的细胞活力。（2）收集各组细胞进行AnnexinV-FITC染色，流式细胞仪统计细胞凋亡情况，以建立细胞凋亡模型，Westernblot法检测各组细胞凋亡相关蛋白bcl-2，bax表达。（3）为了解过量鞣花酸对细胞线粒体功能状态的影响，收集各组细胞流式细胞仪分别进行荧光探针DCFH-DA活性氧检测，jc-1染色检测线粒体膜电位变化；同时将各组细胞以共聚焦培养皿培养，共聚焦显微镜观察各组细胞形态，活性氧，线粒体膜电位变化；qRT-PCR法检测线粒体功能相关PINK1，Parkin，BNIP3，FUNDC1，LCB3，P62mRNA表达。（4）为进一步了解过量鞣花酸造成的HK-2细胞发生细胞凋亡的潜在机制，选取细胞凋亡组（鞣花酸100μM，48h）和正常组进行转录组学测序分析，KEGG和GO功能富集分析差异基因表达情况，同时选取与细胞凋亡相关，线粒体相关差异基因分别进行相关性分析，以探究过量鞣花酸导致肾小管上皮细胞发生细胞凋亡的潜在机制和相关通路，以及对线粒体功能的影响。 结果：过量鞣花酸对HK-2细胞细胞活力与细胞凋亡的影响（1）用50,100,150,200μM鞣花酸分别处理HK-2细胞24h，48h后，CCK-8结果显示，与正常组相比：干预时间24h，48h内，50μM，100μM，150μM，200μM鞣花酸处理组的细胞活力下降呈剂量依赖，且均具有显著性差异（plt;0.05)，另外细胞活力的下降也随时间变化。（2）用50,100,150,200μM鞣花酸分别处理HK-2细胞48h后，AnnexinV-FITC染色结果显示，与正常组相比：干预时间为48h时，100μM，150μM，200μM鞣花酸处理组的HK-2细胞发生细胞凋亡呈剂量依赖，均有显著性差异（plt;0.0001）。Westernblot结果显示：与正常组相比：100μM，150μM，200μM鞣花酸处理组抗凋亡蛋白bcl-2表达减少，均具有显著性差异（plt;0.05）。150μM，200μM鞣花酸处理组凋亡蛋白bax表达增加，且有显著性差异（plt;0.05）。过量鞣花酸对HK-2细胞线粒体功能的影响。（1）用50,100,150,200μM鞣花酸分别处理HK-2细胞24h后，jc-1染色结果显示，与正常组相比：50,100,150,200μM鞣花酸处理组的细胞线粒体膜电位均有下降，具有显著性差异（plt;0.0001）。共聚焦显微镜结果显示，与正常组相比：鞣花酸处理组的细胞形态发生改变，出现拖尾拉长，以及核破裂细胞碎片的增多。红色荧光表达减少以及绿色荧光增多预示线粒体膜电位的降低。（2）用50,100,150,200μM鞣花酸分别处理HK-2细胞6h后，活性氧（ROS）流式结果显示，与正常组相比：50,100,150,200μM鞣花酸处理组细胞内活性氧产生增多，且有显著性差异（plt;0.05）。共聚焦显微镜结果显示，与正常组相比：鞣花处理组的HK-2细胞内绿色荧光增强，且细胞大小形态发生改变。（3）用50,100,150,200μM鞣花酸分别处理HK-2细胞24h后，qRT-PCR结果显示，与正常组相比：鞣花酸处理组的PINK1mRNA表达增加，但无显著性差异（pgt;0.05）；ParkinmRNA表达减少，其中150μM鞣花酸处理组中有显著性差异（plt;0.05）；BNIP3mRNA表达增加且均有显著性差异（plt;0.05），FUNDC1mRNA表达减少，其中150，200μM鞣花酸处理组有显著性差异（plt;0.05）；LC3BmRNA表达增加，其中100，200μM鞣花酸处理组有显著性差异（plt;0.05）；P62mRNA表达增加，其中100，150，200μM鞣花酸处理组有显著性差异（plt;0.05）。转录组学测序相关分析过量鞣花酸造成细胞凋亡潜在机制（1）与正常组相比，凋亡组共有5079个基因显著变化，其中包括2277个基因显著上调和2802个基因显著下调（plt;0.05）。（2）对差异表达基因进行注释分析和功能富集分析，GO注释分析中差异表达基因分子功能主要集中于细胞免疫应答过程，细胞对外界刺激的应答反应，细胞发育过程和细胞成分的生物合成过程，主要集中在细胞外区域，细胞的膜结构，细胞器和细胞内蛋白复合物上。主要富集在细胞代谢，生物调控，代谢过程，细胞成分等方面。KEGG注释分析中差异表达基因主要与人类疾病产生，生物体系统，细胞过程，细胞对环境信息的处理，细胞内遗传信息的处理，细胞内代谢相关。GO功能富集分析主要富集于肾小管上皮细胞的发育和分化调节，糖代谢过程，细胞周期相关酶的调控以及周期调节基因，免疫反应，生长因子，内质网应激相关通路以及内质网应激过载反应，DNA损伤的内源性凋亡信号通路，免疫细胞的激活等，KEGG功能富集分析中主要富集于免疫相关通路和与细胞生长代谢相关通路，低氧诱导通路，核苷酸代谢，与细胞生长失调相关疾病，感染性疾病，自身免疫性疾病上，与细胞凋亡，细胞自噬相关。（3）凋亡相关差异基因GO功能富集分析显示，凋亡相关差异基因主要富集于线粒体组织的调节线粒体外膜透化参与凋亡信号通路的调控，对蛋白质定位的建立具有正调控作用，半胱氨酸型内肽酶活性的激活参与，以及肽酶活性的正调节，蛋白质在膜上定位的调节，外源性凋亡信号通路，细胞凋亡执行期，凋亡信号通路的正调控，蛋白质膜定位的正调控。KEGG通路富集分析显示，凋亡相关差异基因主要富集于TNF通路，NF-KB通路，MAPK通路，FOXO通路上。（4）线粒体相关差异基因GO功能富集分析显示，线粒体相关差异表达基因主要富集于线粒体代谢稳态和线粒体自噬，细胞凋亡等。KEGG通路富集分析显示，线粒体相关差异表达基因主要富集于活性氧的产生，氧化磷酸化过程，脂肪酸合成与代谢，线粒体功能障碍相关的神经退行性疾病，糖脂代谢紊乱相关的疾病，核苷酸代谢等。对线粒体相关差异表达基因按一定标准筛选进行了基因聚类分析显示，上调的差异基因功能表达主要在于DNA损伤的诱导，线粒体自噬，细胞缺氧下转录本表达以及缺氧下参与细胞线粒体凋亡途径的正调节，细胞生长停滞，细胞免疫激活等；下调基因的差异表达功能主要在于参与线粒体呼吸链复合物组成，呼吸链电子运输相关，脂肪酸代谢，核苷酸代谢，糖酵解，参与ATP合成相关，与DNA损伤修复和保护相关，与线粒体偶联蛋白，参与线粒体翻译和蛋白质代谢相关等。 结论：过量鞣花酸对肾小管上皮细胞（HK-2细胞）具有细胞毒性，导致细胞活力下降，细胞线粒体活性氧升高，膜电位下降，线粒体自噬障碍，细胞凋亡的产生，其中细胞凋亡的产生与线粒体功能障碍有潜在关系。
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