摘要
背景和目的 肺纤维化是以肺泡上皮细胞慢性损伤后异常修复所导致的肺组织重构为特征的间质性疾病，其发病机制主要是肺成纤维细胞分化引起的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)蛋白过度表达与清除失衡。但目前对纤维化疾病的研究多数还停留在抑制纤维化发展和恶化方面，而对已建立纤维化组织ECM的清除研究较少。多酚类化合物绿原酸具有抗氧化和抗炎特性，而且绿原酸对纤维化疾病有一定的抑制作用，但其潜在机制并不清楚。自噬和内吞都是基于膜囊泡的细胞途径，用于降解和回收细胞内和细胞外成分，二者共享部分分子机制。研究表明，自噬与内吞作用相互依赖。已建立纤维化组织的消退主要涉及细胞的内吞作用，而绿原酸具有显著的促进自噬的能力。因此我们提出绿原酸是否可以通过增强内吞作用促进纤维化的消退来抑制纤维化疾病的发展，并探索其潜在的作用机制。 方法 (1)体内实验探究绿原酸抑制小鼠肺纤维化的机制 博来霉素(10U/kg)支气管给药诱导小鼠肺纤维化模型，100mg/kg/day绿原酸灌胃给药，4weeks或8weeks后处死小鼠。首先，我们利用HE染色、天狼星红染色以及WesternBlot、RT-PCR探究绿原酸对肺纤维化的影响;其次利用WesternBlot实验检测绿原酸对自噬的影响，利用石蜡组织切片HE染色、天狼星红染色检测绿原酸对纤维化消退影响;利用非靶向代谢组学初步探究绿原酸改善纤维化的潜在机制;同时利用RT-PCR、MDA试剂盒、SOD试剂盒探究绿原酸对氧化应激影响。 （2）体外实验探究绿原酸抑制TGFβ处理的成纤维细胞纤维化发展的机制 从1月龄雄性SD大鼠肺组织中分离培养原代肺成纤维细胞，5ng/mLTGFβ处理模拟纤维化环境，再加入绿原酸处理，利用WesternBlot、RT-PCR以及免疫荧光研究绿原酸对纤维化影响;其次利用WesternBlot、DQcollagen溶酶体共定位探究绿原酸对成纤维细胞和TGFβ处理的成纤维细胞自噬及内吞作用影响;其次利用DHE染色、MDA试剂盒、WesternBlot、RT-PCR探究绿原酸对TGFβ处理的成纤维细胞氧化应激的影响;最后使用自噬抑制剂3-MA和强氧化剂过氧化氢处理细胞，利用WesternBlot、DQcollagen溶酶体共定位实验探究抑制内吞作用或增强细胞氧化应激对绿原酸改善纤维化效应的影响。 结果 （1）绿原酸抑制肺纤维化 体内实验:绿原酸减轻模型小鼠肺内的胶原沉积，改善肺纤维化，可以通过石蜡组织切片染色验证;绿原酸在蛋白和基因层面上抑制纤维化相关标志物表达，可以通过WesternBlot、RT-PCR验证。 体外实验:绿原酸减轻TGFβ处理的成纤维细胞纤维化发展，可以通过WesternBlot、RT-PCR、免疫荧光验证。 （2）绿原酸通过促进成纤维细胞内吞作用抑制肺纤维化 体内实验:博来霉素组与对照组相比，自噬增强，且绿原酸组与博来霉素相比，增强更加明显，可以通过WesternBlot验证。 体外实验:绿原酸组成纤维细胞相较于空白对照组，自噬增强，可以通过WesternBlot、免疫荧光验证;TGFβ处理的成纤维细胞内吞作用减弱，胶原降解能力下降，而绿原酸组内吞作用增强，胶原降解明显增强，可以通过DQcollagen溶酶体共定位、WesternBlot验证。 体内实验:绿原酸给药8weeks小鼠模型与4weeks小鼠模型对比，肺组织内胶原沉积减少，纤维化症状减轻，说明绿原酸促进胶原降解，促进纤维化的消退，可以通过石蜡组织切片染色验证。 （3）代谢组学显示肺纤维化的发生与抗氧化减弱有关 绿原酸可以显著逆转博来霉素诱导的纤维化小鼠肺组织代谢重构，增强抗氧化能力，可以通过非靶向代谢组学分析验证。 （4）绿原酸通过减轻氧化应激抑制肺纤维化 在体内实验和体外实验中，纤维化时成纤维细胞抗氧化能力减弱，氧化应激增强，而绿原酸能够增强抗氧化能力，减轻氧化应激，可以通过WesternBlot、RT-PCR、MDA试剂盒等实验结果验证。 (5)绿原酸通过减轻氧化应激促进成纤维细胞内吞作用，改善肺纤维化 体外实验中，抑制成纤维细胞内吞后，胶原蛋白沉积加剧，纤维化增强，可以通过WesternBlot验证;增强氧化应激后成纤维细胞内吞作用被抑制，胶原蛋白降解减弱，纤维化增强，证明绿原酸通过减轻氧化应激促进成纤维细胞内吞作用，增强胶原降解，进而改善肺纤维化，可以通过WesternBlot、DQcollagen溶酶体共定位验证。 结论 绿原酸通过减轻氧化应激促进肺成纤维细胞的内吞作用，增强胶原蛋白降解，促进纤维化的消退，进而改善肺纤维化。
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