摘要
对地球上所有生命而言，基因组DNA是它们体内最大和最重要的分子，存储生命的遗传信息并指导RNA与蛋白质的合成，后两者调控和执行了几乎所有的生命过程和功能。基因组的测序、定点编辑和局部突变、全局调控网络的绘制以及从头设计和人工合成，帮助人们从不同层面了解、干涉甚至改造生命，实现从致知到致用的跨越。另一方面，这个世界上的生命复杂程度绝非靠人工理性设计而来，而是通过一种简单而优雅的力量被制造出来，即进化。遗传密码持续、递增地引入突变,可以使不同生物个体从旧的或者完全平行的功能发展出全新的功能。学习利用这种自然过程而出现的定向进化(DirectedEvolution)技术同样赋予我们认识和改造生命的能力。 结合上述背景和我们实验室的具体需求，本文展示了三个与基因组调控网络、定点编辑和局域突变相关的课题，分别是:1)利用胞嘧啶脱氨酶AID蛋白和T7RNA聚合酶的融合体对基因组特定区域进行突变;2)将胞嘧啶脱氨酶AID融合到转录因子上以帮助在体内检测转录因子的全基因组作用位点。3)基于单次等位基因交换的原理，开发一套可用于基因组上基因失活和融合、基因元件替换、启动子原位转录型报告系统构建和长片段敲除等操作的质粒系统。这三个项目均在我们实验室所用的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中得到了验证。 课题1:FAST-TM(FusingAIDtoSpecificT7RNApolymeraseforTargetedlocusMutagenesis)。定向进化技术重要的一环是制造靶标基因的突变文库。AID蛋白可以把单链DNA上的碱基C突变为T;T7RNA聚合酶可以特异性地从T7启动子开启转录。将AID蛋白融合到T7RNA聚合酶上，这样随着融合蛋白从T7启动子开始转录，AID蛋白可以在下游基因区域制造突变。我们首先将一段带有T7启动子的荧光蛋基因序列(PT7-mScarlet)插入铜绿假单胞菌基因组，并诱导融合蛋白表达，结果可以同时检测到荧光和基因序列上的突变，初步证实了方法的可行性。之后我们用卡那霉素抗性恢复实验研究了方法的特异性，即利用融合蛋白诱导突变不同启动子下的失活kanS基因，结果显示只有T7启动子下的kanS基因上人为引入的点突变被修复从而恢复抗性。我们还对基因组上插入的PT7-mScarlet序列进行高通量测序，结果显示相比于单独表达AID蛋白的对照组,AID和T7RNA聚合酶融合蛋白组在整个mScarlet基因区域即使是末端都可以检测到较高的突变频率。最后使用这种方法我们成功在24小时内使野生型PAO1进化出针对氨基糖苷类抗生素的抗性。 课题2:MutID(Mutation-basedprotein-DNAInteractionDetection)。以往的检测蛋白质和基因组DNA相互作用的技术大都使用免疫沉淀来捕获目标蛋白结合的DNA片段，需要经过复杂的操作并且高度依赖目标蛋白的抗体。我们利用AID的突变能力，开发了一种基于标记的方法来检测体内蛋白质和基因组DNA相互作用。类似于第一个课题，我们将AID蛋白融合到铜绿假单胞菌转录因子LasR蛋白上，随着LasR蛋白结合到基因组，融合的AID蛋白可以在结合点附近留下突变。理论上检测这些突变就可以逆向获得融合蛋白也就是LasR在全基因组范围的结合信息。首先我们以一个已知受到LasR调控的启动子PrhlI为例验证了融合蛋白可以在LasR结合序列附近留下突变，并比较了不同融合链对突变效果的影响。之后我们通过高通量测序检出了融合蛋白在铜绿假单胞菌基因组留下的二十个突变痕迹，对应了十六个启动子区域和四个蛋白编码区。这十六个启动子中有十个是之前报导过的（共35个），其余六个使用体外的凝胶迁移实验验证确实和LasR蛋白相互作用。我们还研究了启动子上突变和转录的关系，并对MutID方法的优缺点和改进方向进行了讨论。 课题3:基因编辑工具pln2系列质粒的构建和应用。该课题最初的目的是为开发一种简便快捷的铜绿假单胞菌基因敲除方法。为此我们构建了一个最小化的铜绿假单胞菌整合型质粒pln2,当需要失活基因时，只需将目标基因内部一段序列克隆到pln2质粒并导入细菌，质粒不能在细菌内自我复制而只能通过单次等位基因交换整合到基因组上，这样就使目的基因断裂为两部分而失去活性。在pln2的基础上我们开发了一系列不同用途的质粒并用于基因组的不同操作，包括:融合荧光蛋白基因、替换基因元件（如启动子）、构建原位的转录型荧光报告系统、大片段敲除等。在大片段敲除的工作中，我们借助pln2系统将两个FRT位点插入到目标片段的两侧并诱导翻转酶FLP表达来删除FRT位点之间的序列。利用这种方法，我们成功敲除了铜绿假单胞菌三型分泌系统基因簇（25kbp）、类原噬菌体DNA基因簇（22kbp）,更进一步敲除了PA1184-PA1373、PA2264-PA2452两段共约470kbp超长的片段。这样共删除了铜绿假单胞菌基因组8.3％的序列。
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