摘要
急性肺损伤(Acutelunginjury,ALI)是儿科常见的急危重症，临床治疗相对困难，死亡率30％-40％,其严重形式是急性呼吸窘迫综合征(Acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)是导致患儿死亡的常见原因，因此探索急性肺损伤有效治疗药物尤为重要。 血管生成素-2(Angiopoietin-2,Ang-2)可促进炎症反应、导致血管完整性丧失，激活炎症反应亦可加重肺泡毛细血管通透性。血清Ang-2水平升高可作为内皮细胞损伤、血管通透性增高的重要标志。Ang-2在急性肺损伤中的作用主要表现在炎症反应和血管渗漏方面。血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)可增加血管通透性，被称为血管通透性因子，参与肺内血管的迁移和增殖。VEGF的过度表达有助于急性肺损伤中毛细血管通透性的增加。 乌司他丁(Ulinastatin,UTI)是一种广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂,可降低血管的通透性，并阻断炎症因子的释放，可用于ALI的治疗。有研究发现，在肿瘤的治疗中，靶向Ang-2和VEGF的药物被证明是互补的，并且优于单独靶向任何一种药物。那么在ALI中，Ang-2和VEGF均与血管通透性相关，我们对UTI对ALI的改善是否与Ang-2、VEGF的表达均具有靶向关系进行了相关研究。 本研究以幼年雄性SD大鼠为研究对象,用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导建立ALI动物模型，并用UTI干预治疗。测定肺的湿/干(W/D)比率评估肺组织的水肿情况;观察肺组织的病理变化及计算肺损伤分数评估肺损伤程度;检测ALI幼年大鼠外周血中Ang-2、VEGF、TNF-α、IL-6的表达及肺组织中Ang-2、VEGF的表达情况，并进一步研究UTI对急性肺损伤的作用及机制，证明UTI在ALI治疗中的作用。 研究目的 观察Ang-2和VEGF在脂多糖诱导的ALI幼年SD大鼠中的表达，进一步研究UTI对ALI的作用及机制，为临床药物选择提供依据。 研究方法 选用18-21日龄幼年SD雄性大鼠(90只)随机分为五组(每组18只)。模型组采用腹腔注射LPS10mg/kg(1mg/mL)建立幼年SD大鼠ALI模型，对照组给予等剂量的生理盐水，乌司他丁干预组分别在腹腔注射LPS后立即给予注射UTI(5000U/mL),分为乌司他丁低剂量组(LPS+5ml/kgUTI)、乌司他丁中剂量组(LPS+10ml/kgUTI)、乌司他丁高剂量组(LPS+20ml/kgUTI)。注射后，密切观察每组大鼠的呼吸状况、精神状态及饮食、大便等情况。在6h、12h、24h每组随机选取6只大鼠进行眼球取血，处死并解剖，留取肺组织。测定肺的W/D比率，以评估肺组织的水肿情况。采用常规苏木精-伊红(HE)染色法观察肺组织的病理变化。采用酶联免疫吸附法(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检测血清Ang-2、VEGF、TNF-α、IL-6水平变化。采用免疫组化染色观察肺组织Ang-2、VEGF表达部位及表达水平，采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot分析，分别检测Ang-2、VEGF的mRNA和蛋白的表达。 结果 1.腹腔注射3h后，模型组大鼠即出现呼吸急促、精神萎靡、反应差、竖毛、眼周分泌物增多和大便稀等现象，随时间进展症状加重，乌司他丁干预组症状较模型组减轻，较对照组明显。 2.不同时间点，模型组的肺组织W/D比值均高于对照组，乌司他丁低剂量组肺组织W/D比值均低于模型组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）;12h乌司他丁中剂量组肺组织W/D比值低于模型组（P＜0.05）。 3.模型组大鼠肺泡间隔明显增宽，肺泡结构破坏，可见炎症细胞浸润、肺泡腔出血，随时间延长病变逐渐明显，乌司他丁各组肺组织病变较轻。不同时间点，模型组的肺损伤分数均高于对照组，乌司他丁低剂量组的肺损伤分数均低于模型组（P＜0.05）;12h、24h乌司他丁中、高剂量组的肺损伤分数均低于模型组（P＜0.05）。 4.对照组血清Ang-2、VEGF、TNF-α、IL-6水平随时间增加差异无统计学意义;模型组血清Ang-2、VEGF、TNF-α、IL-6水平于6h明显升高，随时间延长于12h、24h逐渐下降（P＜0.05）。不同时间点，模型组血清Ang-2、VEGF、TNF-α、IL-6水平均高于对照组（P＜0.05）,乌司他丁低剂量组血清Ang-2、VEGF、TNF-α、IL-6水平均低于模型组（P＜0.05）;12h、24h乌司他丁中剂量组血清Ang-2、VEGF、IL-6水平均低于模型组（P＜0.05）,12h乌司他丁中剂量组血清TNF-α水平低于模型组（P＜0.05）;不同时间点，乌司他丁高剂量组血清VEGF水平低于模型组（P＜0.05）。相关性分析显示，血清Ang-2水平与VEGF、TNF-α、IL-6水平均呈显著正相关（P＜0.05）。 5.免疫组化结果显示，不同时间点，模型组大鼠肺组织中Ang-2和VEGF的表达均较对照组强，乌司他丁干预组大鼠肺组织中Ang-2和VEGF的表达均较模型组弱。 6.RT-PCR结果显示，模型组Ang-2和VEGFmRNA的表达量随时间增加而增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）;不同时间点，模型组Ang-2和VEGFmRNA的表达量均高于对照组，乌司他丁低剂量组的表达量均低于模型组（P＜0.05）;不同时间点，乌司他丁中、高剂量组Ang-2mRNA的表达量均低于模型组（P＜0.05）;6h、12h乌司他丁中剂量组VEGFmRNA的表达量均低于模型组，6h乌司他丁高剂量组VEGFmRNA的表达量低于模型组（P＜0.05）。相关性分析显示，肺组织中Ang-2mRNA与VEGFmRNA的表达量呈显著正相关（P＜0.05）。 7.Westernblot结果显示，模型组Ang-2和VEGF蛋白的表达随时间增加而增加，差异均具有统计学意义（P＜0.05）;不同时间点，模型组Ang-2和VEGF蛋白的表达均高于对照组，乌司他丁低剂量组的表达均低于模型组（均P＜0.05）;6h时乌司他丁中剂量组Ang-2蛋白的表达显著低于模型组（P＜0.05）;不同时间点，乌司他丁中剂量组VEGF蛋白的表达均低于模型组（P＜0.05）;24h乌司他丁高剂量组VEGF蛋白的表达低于模型组（P＜0.05）;不同时间点，乌司他丁低剂量组Ang-2和VEGF蛋白的表达均低于乌司他丁高剂量组（P＜0.05）;12h、24h乌司他丁低剂量组Ang-2和VEGF蛋白的表达均显著低于乌司他丁中剂量组（P＜0.05）。相关性分析显示，肺组织中Ang-2蛋白与VEGF蛋白的表达量呈显著正相关（P＜0.05）。 结论 1.Ang-2和VEGF在LPS诱导的幼年SD大鼠ALI外周血和肺组织中表达均明显增高，均参与了ALI的发生发展过程，且与肺损伤程度有关。 2.Ang-2和VEGF存在正相关，两者均可作为ALI治疗的潜在靶点。 3.UTI可能通过抑制Ang-2和VEGF的表达改善ALI,低剂量较中、高剂量肺保护作用更加明显。
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