摘要
背景与目的：良性胆道狭窄（Benignbiliarystrictures，BBS）是指由胆管损伤、反复胆管炎所致的纤维组织大量增生、胆管壁增厚、胆管瘢痕性缩窄，可引起反复的肝功能损害、胆汁性肝硬化甚至肝功能衰竭。目前仍缺乏治疗BBS的有效方法，如何有效治疗BBS是临床中的一项挑战。在胆管损伤修复的过程中，胆管组织的修复重建与创口的愈合质量及瘢痕增生程度密切相关。重组人Ⅲ型胶原蛋白水凝胶（RecombinanthumantypeⅢcollagenhydrogel，RHCⅢ）作为一种新型修复材料，可改善瘢痕愈合质量，临床应用价值较高。本研究的目的是在建立良性胆管狭窄兔模型基础上，探讨经胆道输注重组人Ⅲ型胶原蛋白水凝胶治疗良性胆道狭窄兔模型的有效性及安全性。 方法：第一部分：新型良性胆道狭窄兔模型的建立及评估：通过损伤胆管联合胆囊切除术，经胆囊管插入引流管，置于体外，从而建立一种新型良性胆道狭窄兔模型，通过术后临床特征、血清学、影像学、病理学分别验证该模型的可行性、可重复性及可靠性。第二部分：新型药物RHCⅢ治疗BBS的疗效探究：（1）体外实验：通过CCK-8方法检测良性胆管狭窄肌成纤维细胞（Benignbileductstricturemyofibroblasts,BBSMF）的细胞相容性及细胞毒性；免疫荧光染色探讨不同浓度RHCⅢ对BBSMF相关细胞因子表达的影响。（2）体内实验：选择20只体重为2.5kg雄性新西兰兔，随机分为4组，A组假手术对照组，B组模型对照组（0.9%生理盐水），C组低浓度治疗组（0.5%RHCⅢ），D组高浓度治疗组（2%RHCⅢ）。从次日起，B、C、D组每隔3天经导管缓慢输注3ml药物，直至完成14天的治疗周期。观察记录各组实验兔术后临床特征；并于第14天处死各组实验兔以获取标本观察肝脏及胆管形态学改变；同时通过血清学评估术后梗阻性黄疸指标变化；采用病理学方法对比各组间组织学结构及胶原纤维沉积变化；ELISA方法分别测定各组的组织中转化因子-β1（TGF-β1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的浓度，从而分别从细胞水平、动物水平及分子水平来评估RHCⅢ水凝胶对治疗良性胆道狭窄的安全性及有效性。 结果：第一部分：新型良性胆道狭窄兔模型成功建立:观察各组实验兔术后临床特征，与A组相比，B组兔模型中，伴随有耳缘黄染、大小便颜色改变等渐进性黄疸临床表现；血清学结果表明，BBS兔模型梗阻指标显著高于假手术组；胆道造影示模型组呈BBS影像学改变；病理学结果表明，模型组胆管壁增厚，瘢痕过度增生，各层组织中出现急性、慢性炎症，肝脏呈胆汁性肝硬化表现。以上结果表明，本课题组成功建立了良性胆道狭窄兔模型，且该模型方法具有良好的可行性、可重复性及可靠性。第二部分：新型药物RHCⅢ对BBS治疗有效：体外实验表明，与对照组相比，5mg/mlRHCⅢ药物组可以显著抑制BBSMF的体外增殖，差异有统计学意义(P＜0.01)；免疫荧光结果表明，5mg/mlRHCⅢ药物组可以显著抑制TGF-β1蛋白表达，差异有统计学意义(P＜0.01)。体内实验表明，与B组相比，C组ALT及TBIL水平明显减低，差异有统计学意义(P＜0.001)，DBIL、ALP、GGT水平减低，差异有统计学意义(P＜0.01)。与B组相比，C组WBC、NE水平减低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。病理学检测苏木精-伊红染色及马松染色均显示，与B组相比，C、D组的胆管壁组织增生及胶原蛋白沉积减少，炎症细胞浸润减少，并显著改善了胆汁淤积导致的继发性胆汁肝硬化，C组疗效好于D组。ELISA实验结果表明，与B组相比，C、D组可显著降低BBS兔模型中的瘢痕因子水平，降低TGF-β1和α-SMA蛋白的表达，差异具有统计学相关性（C组：P＜0.01；D组：P＜0.05）。 结论：第一部分：本实验成功建立一种改良的良性胆道狭窄兔模型。该模型能够模拟良性胆道狭窄发生发展过程，并且可以通过血清学、胆道造影及病理学检查评估BBS病变，从而应用于临床新疗法的决策。第二部分：胆道输注重组人Ⅲ型胶蛋白水凝胶可有效抑制体外良性胆管狭窄肌成纤维细胞的增殖及良性胆道狭窄兔模型中的胆管壁不良增生，从而限制狭窄的形成。该治疗方法具有治疗胆道狭窄的潜力，为今后BBS的临床治疗决策提供了新思路。
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