摘要
【目的】 1.比较非小细胞肺癌细胞A549及A549耐受吉西他滨株A549/G+中PDK4的表达差异，以及吉西他滨浓度对PDK4表达水平的影响。 2.观察抑制PDK4表达与吉西他滨作用后对非小细胞肺癌细胞A549和对吉西他滨耐受的A549/G+增殖、划痕愈合、迁移、侵袭和凋亡能力的影响。 3.比较A549细胞和A549/G+细胞在吉西他滨与抑制PDK4的作用下细胞代谢水平的改变。 4.分析在A549吉西他滨耐药株中抑制PDK4导致吉西他滨耐受的潜在机制 【方法】 1．通过RNA测序比较PDK4在A549和A549/G+中的表达差异。 2.用RT-qPCR和Western-blot分别在转录水平和蛋白水平比较PDK4的表达差异。 3．在A549细胞和A549/G+细胞中转染shRNA-PDK4，并进行敲减效率的验证以及用CCK8细胞毒性实验和克隆形成实验分析两种细胞对吉西他滨耐药的程度及细胞增殖情况。 4．通过细胞划痕实验、细胞迁移和侵袭实验，比较A549和A549/G+细胞在shRNA-PDK4和吉西他滨作用下细胞迁移和侵袭能力的变化。 5．在A549/G+细胞中转染shRNA-PDK4，用流式凋亡实验检测PDK4被抑制前后细胞凋亡率的变化；用蛋白免疫印迹方法比较PDK4被抑制前后细胞修复和损伤及凋亡有关的蛋白PARP1、γ-H2AX、Bcl-2的水平变化。 6．通过葡萄糖消耗实验、乳酸生成实验和ATP生成实验，比较抑制PDK4联合吉西他滨对A549及A549/G+细胞代谢水平的影响。 【结果】 1.RNA测序结果显示A549/G+细胞中PDK4的水平较A549升高2.66倍（P=4.16E-90）。 2.A549/G+细胞中PDK4的转录水平（P＜0.001）和蛋白水平（P＜0.05）均高于A549细胞。 3.shRNA-PDK4在转录水平（P＜0.05）和蛋白水平（P＜0.01）均能有效抑制PDK4的表达。CCK8实验中，在A549及A549耐受吉西他滨株A549/G+细胞中加入吉西他滨使细胞增殖能力明显下降，抑制PDK4使细胞增殖能力增强，且差异具有统计学意义（P＜0.01）。细胞克隆形成实验中，在A549及A549耐受吉西他滨株A549/G+细胞中加入吉西他滨使细胞克隆形成能力明显下降，抑制PDK4使细胞克隆形成能力增强，且差异具有统计学意义（P＜0.001）。 4.在A549及A549耐受吉西他滨株A549/G+中加入吉西他滨使细胞划痕面积变大、迁移和侵袭能力明显下降，抑制PDK4使细胞划痕面积变小、迁移和侵袭能力增强，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。 5.流式凋亡检测结果显示，在A549/G+细胞中抑制PDK4表达明显降低了细胞的凋亡率。Western-blot结果显示，Bcl-2、PARP表达上调（P＜0.05），γ-H2AX水平无明显变化。 6.在A549及A549耐受吉西他滨株A549/G+中抑制PDK4表达明显增加了葡萄糖消耗水平、乳酸生成水平以及ATP生成水平（P＜0.001）。 【结论】 1.PDK4在A549/G+中的表达量无论是RNA测序结果，还是转录水平和蛋白水平，均明显高于A549细胞。 2.在A549细胞与A549/G+细胞中抑制PDK4的表达能够明显增强细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并明显降低细胞的凋亡率。 3.在A549细胞与A549/G+细胞中抑制PDK4的表达能够明显增强细胞代谢，促进葡萄糖的消耗、乳酸的生成以及ATP的生成。
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