摘要
【目的】 1.设计不同孔径的三周期极小曲面（TriplyPeriodicMinimalSurface，TPMS）G曲面结构，使用基于数字激光加工（DigitalLaserProcessing，DLP）的增材制造（AdditiveManufacturing，AM）技术，以这些结构为蓝本制备β-磷酸三钙（β-TricalciumPhosphate，β-TCP）骨组织工程支架。 2.探究不同孔径TPMS-G曲面β-TCP骨支架在体外环境中的表面形貌、机械强度、细胞相容性和促成骨能力。 3.探究不同孔径TPMS-G曲面β-TCP骨支架在下颌骨缺损体内环境中，内部新生骨组织的状态，总结不同孔径TPMS-G曲面结构在体内的成骨特点。 【方法】 MatlabR2020a软件设计330μm、420μm和510μm三种不同孔径的TPMS-G曲面结构。MaterialiseMagics软件通过内偏移、外偏移及三角面片简化赋予这些结构200μm壁厚，通过布朗交运算获得直径14mm、厚度5mm的圆柱形TPMS-G曲面骨组织工程支架模型。Inspire2018软件观测支架模型的结构设计。基于DLP的AM技术制备TPMS-G曲面β-TCP生物陶瓷支架。扫描电子显微镜观测支架表面形貌；X射线衍射仪分析支架晶体结构类型；万能材料试验机检测支架压缩强度和弹性模量。小鼠颅顶前成骨细胞（MC3T3-E1）与各孔径的支架共培养，CCK8实验检测细胞增殖活性；Live/Dead染色后于活细胞成像仪和激光共聚焦显微镜下观察细胞形态；ImageJ软件计算每组支架单个孔荧光强度总和的均值；RT-PCR以GAPDH为内参，检测细胞成骨相关标志基因（ALP、RUNX2、OCN和COL-1）的相对表达量。建立新西兰兔下颌骨缺损模型，植入各孔径支架2月后处死动物并取缺损区下颌骨行Micro-CT检测，CTvox软件重建支架三维影像并评估支架的骨结合状态。通过骨密度、骨体积百分比、骨表面积骨体积比值、骨表面密度、骨小梁厚度和骨小梁数量等骨参数评估各孔径支架在下颌骨内的骨长入量和骨再生状态。下颌骨样本脱钙后切片，以HE染色、Masson三染和ALP免疫组化染色分析支架内部新生组织的种类和形态。 【结果】 成功以MatlabR2020a和MaterialiseMagics软件设计出三种不同孔径的圆柱形TPMS-G曲面模型。Inspire2018软件显示：TPMS支架模型呈现出光滑、连续、均一的多孔结构，其孔径为330μm、420μm和510μm。基于DLP技术的3D打印机成功制备出330μm、420μm和510μm三种不同孔径的TPMSβ-TCP生物陶瓷支架。扫描电镜结果证实：基于DLP的AM技术实现了TPMS的精确成型。X射线衍射结果证实：支架由高纯度β-TCP晶体构成。万能材料试验机结果表明：三种孔径支架的压缩强度均处于或接近松质骨力学强度范围、弹性模量接近于皮质骨，且支架的压缩强度与孔径大小成反比。CCK8结果表明：在支架孔径330-510μm范围内，支架表面的细胞增殖量与孔径大小呈显著正相关，510μm孔径促进细胞增殖效果最佳。Live/Dead染色和ImageJ软件分析表明：MC3T3-E1细胞能在支架表面早期黏附，510μm孔径支架上的细胞形态最为舒展，呈现出扁平多边形结构；各组支架表面的细胞黏附量随孔径增大而提高。RT-PCR结果显示：在支架孔径330-510μm范围内，ALP、RUNX2和OCN的mRNA相对表达量随孔径增大而上调，COL-1的mRNA相对表达量随孔径增大而抑制。成功建立新西兰兔下颌骨缺损模型，Micro-CT图像表明：各组支架均形成良好的骨结合，且支架孔隙中均有新生骨质长入，510μm孔径支架内部形成了更多疏松多孔的骨小梁结构。在支架孔径330-510μm范围内，骨密度、骨体积百分比、骨小梁厚度和骨小梁数量四个骨参数与孔径大小呈正相关性；骨表面积骨体积比和骨表面密度两个骨参数与孔径大小呈负相关性。HE染色显示：各组支架内部均有新骨长入，510μm孔径支架内部的骨体积、骨密度和骨成熟度最高。Masson三染显示：330和420μm孔径支架内部孔隙的胶原纤维主要分布于孔壁附近，越靠近支架表面的孔隙中胶原纤维越多；510μm孔径支架内部形成了大范围的胶原纤维，但这些胶原并不倾向于分布在孔壁附近。ALP免疫组化染色显示：330和420μm孔径支架内部孔隙的高密度成熟骨组织主要在孔壁附近，孔隙中心主要为新生的疏松骨小梁结构；510μm孔径支架内部存在大量高密度成熟骨质，但这些骨质并不倾向于分布在孔壁附近。 【结论】 1.基于DLP的AM技术成功实现了不同孔径TPMSβ-TCP支架的精确制备。TPMSβ-TCP生物陶瓷支架具有利于细胞攀附的粗糙表面，与人体松质骨相近的压缩强度以及与皮质骨相近的弹性模量；体外细胞实验表明支架具有良好的细胞相容性和促成骨能力；新西兰兔体内实验表明TPMS支架可与下颌骨形成紧密的骨结合，且支架内部有新骨长入。 2.在支架孔径330-510μm范围内，TPMS支架在体外的细胞黏附量、促成骨能力和支架在体内的新生骨体积、骨密度和骨成熟度均随孔径增大而提高。510μm孔径在体外有利于前成骨细胞的黏附、增殖和分化，在体内具有最多的骨长入量和最成熟的骨小梁形态。 3.在支架孔径330-510μm范围内，TPMS支架在体内的骨表面积骨体积比值和骨表面密度两个骨参数随孔径增大而下降。Masson三染和ALP免疫组化染色显示，330和420μm孔径支架倾向于先在支架内部孔隙的孔壁周围形成成熟的高密度骨组织，而510μm孔径支架内部的高密度骨组织则未体现出这种生长倾向。
NETL