摘要
背景:随着中国社会经济的发展，结直肠癌作为一种常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率逐年上升。结直肠癌起病隐匿，晚期死亡率高，因此迫切需要寻找新的预防、早期诊断和治疗方法。随着医学技术的显著提高，许多研究发现肠道菌群失调与结直肠癌的发展密切相关，并且一些特定菌群具有成为结直肠癌诊断生物标志物的潜力。目前,16SrDNA基因扩增子测序是这类研究中使用的主要方法，但该方法在物种鉴定方面通常只能精确到属级别，并且遗漏了大量其他微生物基因，只能通过预测来注释微生物功能。因此，在本研究中采用宏基因组方法分析不同中医证型结直肠癌患者的肠道微生物特征，并通过比较基因组学来研究探讨肠道菌群与结直肠癌中医证型之间的关联和机制，以期为结直肠癌的中医辨证分期提供客观依据，以及为结直肠癌的治疗及早期诊断提供帮助。 目的:通过收集不同中医证型结直肠癌患者的一般信息与粪便样本，并采用宏基因测序技术对其粪便样本进行检测，对比研究不同中医证型结直肠癌患者的肠道微生物组成结构及功能单元，并探讨特定菌群及功能单元与结直肠癌中医证型之间的相关性，以期为结直肠癌的中医辨证分期及治疗提供客观依据。 方法:本研究按照严格的纳入和排除标准，收集2022年1月至2022年12月于南京市中医院肛肠科住院治疗的29例患者，收集患者的年龄、性别、BMI等一般信息并根据中医证型分组，其中湿热蕴结证患者12例，气血亏虚证患者17例。对最终入组患者粪便样本进行宏基因组建库测序并注释，获得样本菌群的丰富度、多样性、生物标志物、特征菌群、组成结构并对样本内微生物功能但会员等进行对比研究。最后，我们分析并探索了肠道菌群结构及相关代谢通路与结直肠癌中医证型之间的相关性。 结果:1.本研究最终纳入研究对象29例，其中湿热蕴结12例，气血亏虚组17例，两组患者在年龄、性别构成和BMI方面的差异均未达到统计学意义（P值均大于0.05）。 2.本研究通过Illumina高通量测序获得了1234229594条高质量序列，并分别计算了两组的4种多样性参数，包括Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数。结果表明湿热蕴结组多样性与丰富度与气血亏虚组存在差异，但差异无统计学意义（P值均大于0.05）。 3.物种方面，厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门是肠道微生物的主要门，其中厚壁菌门在湿热蕴结组中更为丰富，拟杆菌门、变形杆菌门在气血亏虚组中更为丰富。在属水平上,拟杆菌属、类杆菌属、真杆菌属等为优势菌属。湿热内蕴组优势菌属为普氏菌属和瘤胃球菌属等。气血亏虚型患者的优势菌属为双歧杆菌属和肠杆菌属等。PCA分析以及PCOA分析则显示表明两组样本的肠道菌群结构存在差异。但经过ANOSIM分析，发现这种差异并不具有统计学意义（R=0.0001，P=0.44）。功能单元方面:碳水化合物代谢相关功能单元在样本中水平最高，是功能最丰富的类别。PCA及PCoA分析均显示未见明显分离，这表明两组间功能单元多样性不存在显著差异。 4.组间生物学标志物筛选结果显示:菌群物种方面:两组样本共检测到菌种868种,其中湿热内蕴组独有菌种217种，气血亏虚组独有菌种79种，共有菌种572种。LEfSe分析显示两组间共有27种细菌分类的相对丰度存在显著性差异，Eggerthella属等菌群以及放线菌属、丙酸杆菌属等菌群中的部分细菌是分别是湿热内蕴组与气血亏虚组组间具有统计学差异的标志性微生物。功能单元方面:两组样本共检测到功能单元8939种,其中湿热内蕴组独有功能单元1849种，气血亏虚组独有功能单元91种，共有功能单元6999种。LEfSe分析显示两组间共有10种功能单元的相对丰度存在显著性差异。其中与赖氨酸和精氨酸生物合成、Hippo信号通路、阿米巴病相关的代谢通路在湿热蕴结组中富集，同时，乙醛酸及二羧酸代谢以及缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸降解有关的代谢通路在气血亏虚组中富集。 结论:1.湿热内蕴组与气血亏虚组患者肠道菌群结构存在差异，虽然其多样性不具有统计学意义，但存在各分类水平上，尤其是种、属水平上存在具有显著差异的菌群种类。湿热蕴结组厚壁菌门更为丰富，气血亏虚组拟杆菌门、变形杆菌门更丰富。普氏菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属等菌属是湿热蕴结型的优势菌属，双歧杆菌属、克雷伯氏菌属等是气血亏虚型的优势菌属。 2.Eggerthella属等菌群以及放线菌属、丙酸杆菌属等菌群中的部分细菌是分别是湿热内蕴组与气血亏虚组组间具有统计学差异的组间标志性微生物（LDA值均＞2）,它们可能成为结直肠癌辨证分型的客观依据。 3.湿热内蕴组与气血亏虚组患者肠道菌群功能单元多样性未见明显差异。Hippo等信号通路以及缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸降解等信号通路分别是湿热内蕴组与气血亏虚组组间具有统计学差异的标志性功能单元（LDA值均＞2）,他们的可能与结直肠癌的发生发展及不同中医证型结直肠癌的症状表现存在相关，但其详细的机制仍需要进一步探索。
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