摘要
目的:双歧杆菌在生命早期为保护婴儿肠粘膜免受致病细菌侵害方面发挥着关键作用，除了影响宿主的正常生理和疾病易感性，还有助于婴儿免疫系统的发育成熟，因此受到了广泛关注。以两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum）为代表的婴儿型双歧杆菌专性代谢人体母乳寡糖（HMOs）和宿主肠道黏膜上皮黏蛋白聚糖，它们对生命早期健康和发育至关重要。肠道共栖菌与宿主紧密的互利共生关系促使其与宿主人群协同进化，可能造成菌株的宿主特异性，即本地来源菌株益生功能的个体或区域人群有效性。目前对不同人群来源B.bifidum的群体遗传报道较少，本研究旨在探究在有限地域内遗传、饮食相近人群来源的B.bifidum菌株集的遗传结构是否具有族群特异的规律性，为开发个性化的益生菌株提供理论基础。 方法:本研究对新疆伊宁两个族群学龄儿童队列（维吾尔族和哈萨克族）肠道两歧双歧杆菌进行分离和鉴定，共获得115个菌株，对基于rep-PCR指纹筛选的53株代表菌株采用多位点序列分型（multilocussequencetyping,MLST）进行群体遗传差异分析。通过两歧双歧杆菌全基因组重测序和体外益生特性分析:酸和胆盐耐受性、抑菌特性、抗生素敏感性、碳水化合物代谢特性、疏水性及自聚集性分析，进一步揭示不同民族学龄儿童队列两歧双歧杆菌的族群特征。 结果:（1）本研究从哈萨克族和维吾尔族儿童粪便中共分离得到571株双歧杆菌。根据rep-PCR-BOX和rep-PCR-M13指纹图谱，选择分离出的53株代表性两歧双歧杆菌进行MLST分析。对53个代表性菌株的7个基因片段进行了等位基因组合，并通过等位基因组合的唯一性来鉴定ST,结果表明这53株两歧双歧杆菌可以划分为37个ST型，树状图结果表明聚集在一起的菌株大多具有相同的民族来源，有一定的族群特异性。经过goEBURST和七个管家基因串联序列系统发育分析发现，源自同一民族儿童的双歧杆菌菌株之间的系统发育关系明显更为相似，这可能是由于同一民族儿童的生活习惯、饮食结构组成更为相似。7个持家基因及串联序列的劈裂重组分析显示出明显的网状结构，从整体上看，两歧双歧杆菌菌株在进化中经历了重组事件。 （2）选择具有代表性的21株两歧双歧杆菌菌株进行基因草图测序，两歧双歧杆菌基因组大小在2.26Mb～2.44Mb之间,菌株平均GC含量在63％左右，无论是基因数还是基因组大小均与参考的两歧双歧杆菌的基因组无较大差异。ANI值均为99％左右，67个菌株都是同一物种，无任何亚种且两歧双歧杆菌基因组之间只有微小的差异。67株两歧双歧杆菌得到5666个基因家族（MCLgenefamilies）,其中包含863个核心基因组。系统发育树分析表明，本研究中分离出的不同民族双歧杆菌聚集在不同分支上，表明双歧杆菌的系统发育可能与其分离的地理特征有关。21株两歧双歧杆菌基因组均编码GH20（β-己糖胺酶[EC3.2.1.52]）、GT2（纤维素合成酶[EC2.4.1.12]）、GH13（α-淀粉酶[EC3.2.1.1]）、CBM32家族的糖苷水解酶。结果表明两歧双歧杆菌基因组与粘蛋白的分解利用有关。 （3）两歧双歧杆菌对于宿主来源多糖的利用表现出一定的特异性，实验菌株均能利用粘蛋白;少数受试菌株能有限利用低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚果糖等;所有菌株都不能有效利用棉子糖、水苏糖、大豆低聚糖、聚葡萄糖、木糖醇、山梨醇以及甘露醇。通过对两歧双歧杆菌菌株分离株进行抑菌试验，发现大多数菌株对6种致病菌均有抑菌作用，少数菌株对鼠伤寒血清型肠沙门氏菌CICC10420、产肠毒素大肠埃希氏菌CICC10421和血清型肠炎沙门氏菌CGMCC1.10754抑菌效果不明显或没有抑菌活性。耐酸试验结果表明，大部分菌株在pH为4或5时活性较高，在pH为3.5时几乎所有菌株都不能保持活性;耐胆盐试验结果表明，在胆盐浓度为0.04％和0.06％时，菌株存活率较高，当浓度增加到0.08％时几乎所有菌株都不能保持活性。两歧双歧杆菌耐药性试验表明，所有菌株对庆大霉素、阿卡米星和左氧氟沙星表现为耐药。对利福平、万古霉素表现中敏或耐药。部分菌株具有疏水的细胞表面，具有粘附于小肠内壁的潜力。 结论:不同族群来源B.bifidum分离株显示出较高的遗传多样性，群体遗传结构一定程度上呈现出民族族群来源的特异性，需要更大规模的取样证实。为进一步开展体内、外实验，筛选针对区域族群的特色优良益生菌株提供了理论基础。
NETL