摘要
目的： 神经胶质瘤微环境是胶质瘤进展的关键因素。胶质瘤细胞能通过细胞外囊泡（EVs）对胶质瘤微环境中多种类型的细胞进行信息交流与操纵，从而重新塑造其生存微环境，以支持肿瘤的进展和对治疗的抵抗。本课题通过研究Cavin1对胶质瘤来源的EVs的产量和功能的影响，以及胶质瘤分泌的EVs在胶质瘤细胞之间、胶质瘤细胞对小胶质细胞、内皮细胞的信息传递中发挥的作用，从而为胶质瘤的治疗提供新的策略。 方法： 1、通过计算结构生物学方法，包括序列比对、同源建模和分子对接模拟等，设计不与Caveolin1相互作用的变异体Cavin1(vCavin1)。通过扫描电子显微镜分析、BCA蛋白测定、Westernblot免疫印迹实验、NTA粒径分析等方式，检测Cavin1对胶质瘤的EVs的产量的影响。 2、通过流式细胞术、激光扫描共聚焦显微镜分析的方法，检测Cavin1对胶质瘤EVs被受体胶质瘤细胞摄取的影响。利用CCK-8细胞增殖测定法，检测胶质瘤EVs对受体胶质瘤细胞增殖的影响。通过荧光标记、活体动物成像等方法，检测系统应用的胶质瘤EVs向脑胶质瘤归巢的趋势。 3、通过体外小胶质细胞迁移实验、原位胶质瘤小鼠模型，探索胶质瘤细胞通过EVs对小胶质细胞的作用。 4、使用iTRAQ/TMT质谱方法，以研究经原代胶质瘤EVs处理后，bEnd.3内皮细胞的蛋白质组学变化，并通过Westernblot免疫印迹实验对质谱结果进行验证。通过GO分析和蛋白网络分析找出相关信号通路，并利用STAT3磷酸化抑制剂WP1066在内皮细胞进行验证。 5、通过FRAP荧光漂白恢复技术，检测胶质瘤EVs和NGAL蛋白对内皮细胞膜流动性的影响，应用透射电子显微镜观察分析胶质瘤EVs对内皮细胞的内吞的影响。并检测胶质瘤EVs和NGAL蛋白对体外血脑屏障对纳米微囊通透性的影响。 6、通过裸鼠原位胶质瘤模型，探索胶质瘤EVs抑制剂MK2206对纳米微囊穿过血脑屏障进入肿瘤组织的影响，并进一步研究tAb纳米微囊和MK2206不同应用顺序对胶质瘤治疗效果的影响。 结果： 1、Cavin1高表达显著增加胶质瘤细胞EVs产量，而vCavin1表达却对胶质瘤EVs产量无明显影响。 2、Cavin1促进胶质瘤细胞U87的EVs被受体胶质瘤细胞LN229细胞的摄取并且表达Cavin1的U87细胞的EVs以剂量依赖的方式促进受体细胞LN229的增殖，但是vCavin1却不能。 3、Cavin1促进胶质瘤EVs引起的小胶质细胞BV2的募集和活化，但是vCavin1却不能。 4、质谱结果显示，原代胶质瘤EVs引起内皮细胞的NGAL水平显著升高，且很可能是通过JAKs-STAT3信号通路引起。 5、原代胶质瘤EVs通过上调内皮细胞NGAL表达明显地增强了内皮细胞膜流动性和内吞，提高体外BBB对纳米微囊的渗透性。 6、小分子抑制剂MK2206导致穿过BBB的纳米微囊的数量的显著减少与其阻断AKT磷酸化，导致神经胶质瘤的细胞外囊泡的释放减少有关。与tAb纳米微囊-MK2206顺序给药相比，MK2206-tAb纳米微囊顺序给药或单用tAb纳米微囊组别中，进入胶质瘤区域的纳米颗粒数量明显更少。tAb纳米微囊-MK2206顺序给药的治疗效果最佳。 结论： 1、Cavin1表达能提高胶质瘤细胞U87分泌的EVs的产量、促进EVs被受体细胞摄取、增强EVs对受体胶质瘤细胞增殖的促进效应、提高胶质瘤EVs向脑胶质瘤的归巢趋势，以及增强胶质瘤EVs介导的对小胶质细胞的募集和激活作用。而Cavin1的上述效应是通过与Caveolin1相互作用实现的。因此，Cavin1-Caveolin1互作有望成为高表达Cavin1的胶质瘤的新的治疗靶点。 2、原代胶质瘤分泌的EVs作用于脑微血管内皮细胞bEnd.3，通过JAKs-STAT3信号通路，引起NGAL水平升高，造成内皮细胞膜流动性增强、内吞作用增强，使得应用的tAb-纳米微囊能更多的跨越BBB进入胶质瘤组织。因此，应用MK2206之前先应用tAb纳米微囊可以获得脑胶质瘤治疗最大受益。
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