摘要
甘蓝型油菜是我国最主要的油料作物之一，也是我国国产食用植物油的主要来源。近年来，草害和根肿病频发，严重影响了我国油菜的安全生产，但是目前生产上缺少抗除草剂和根肿病的优良油菜品种，因此培育兼抗除草剂和根肿病的甘蓝型油菜新种质对于保障我国食用油供给安全具有非常重要的意义。本研究利用回交选育的方法结合分子标记辅助选择，培育兼抗除草剂和根肿病的甘蓝型油菜新种质。同时通过转基因技术，将根肿病抗性基因转化到抗除草剂的甘蓝型油菜材料中，创制兼抗除草剂和根肿病的转基因甘蓝型油菜种质。主要研究结果如下： 1．以杂合抗根肿病材料T13和纯合抗磺酰脲类除草剂材料DS3为亲本杂交得到F1代，3~5叶期喷施除草剂和接种根肿菌，鉴定表明F1代单株全部具有除草剂抗性，根肿病抗性存在分离；利用除草剂抗性标记筛选，得到16株生长健壮且兼抗除草剂和根肿病的F1代单株，再与抗根肿病亲本T13回交，获得BC1F1代。 2．对BC1F1代幼苗进行除草剂和根肿病表型鉴定，得到18株在表型上兼抗除草剂和根肿病的BC1F1代单株。利用除草剂抗性标记筛选得到12株兼抗除草剂和根肿病的BC1F1代单株，继续进行SSR标记辅助背景选择，获得5株具有除草剂抗性标记且遗传背景回复率在74.08%~87.04%之间的单株，与抗根肿病亲本T13回交，获得BC2F1代。 3．前期研究获得抗根肿病候选基因BnaA02g15190D（BnaA02.MLP）、BnaA02g07380D和BnaA02g32980D，在抗病T13材料中接种根肿菌分析表达情况变化，发现BnaA02.MLP基因受到根肿菌胁迫后相对表达量显著上调，并且分析数据发现，在根肿菌胁迫下，BnaA02.MLP基因在抗、感根肿病材料中的相对表达量存在显著差异，因此选择BnaA02.MLP基因为抗根肿病候选基因。 4．BnaA02.MLP基因含2个外显子，启动子中包含低温、干旱、水杨酸和脱落酸应答元件，主要在根部表达，与根肿菌侵染部位吻合，所编码的乳胶蛋白氨基酸为229，等电点为5.17属酸性蛋白，疏水性为-0.297属亲水蛋白，Bet_v_1结构域为主要保守结构域。甘蓝型油菜乳胶蛋白基因家族成员在基因结构、蛋白结构和理化性质等方面非常相似，同时顺式作用元件和组织表达量分析表明该家族可能在植物调节生长发育和响应胁迫中发挥功能，有研究证明BnaA02.MLP基因在拟南芥中的同源基因AtMLP28受根肿菌胁迫显著上调表达。综合以上结果，BnaA02.MLP基因可能具有抗根肿病的功能。 5．在根肿病抗性材料T13中克隆了BnaA02.MLP基因的编码序列，并构建了过表达载35S::BnaA02.MLP。进一步通过农杆菌介导的下胚轴转化法将过表达重组载体转化到抗除草剂甘蓝型油菜材料DS3中，目前已获得8株T0代植株。 本研究分别运用分子标记辅助选择和转基因技术创制兼抗除草剂和根肿病的种质，为我国油菜抗除草剂和抗根肿病育种提供材料基础。
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