摘要
蜀葵是全球广泛种植的花卉，具有较好的观赏价值，抗逆性强，蜀葵病毒病害的发生给蜀葵的生长造成严重的影响。明确蜀葵病毒病害的种类和变异进化是蜀葵病毒病害的防治工作的基础。高通量测序技术检测病毒方法突破了传统的局限性，能对已知未知的病毒进行测定。 本研究通过小RNA深度测序检测了表现花叶脉明症状的蜀葵的病毒病害。通过小RNA的拼接得到contigs，再通过比对分析，设计特异引物扩增得到3种病毒，分别是锦葵脉明病毒（Malaveincleaningvirus，MVCV）、西瓜花叶病毒（Watermelonmosaicvirus，WMV）和1种新的RNA病毒，暂命名为蜀葵病毒1号（Althaearoseavirus1，ArV1）。 锦葵脉明病毒是马铃薯Y病毒属成员之一，发现该病毒已久，但目前还未有全序列的报道。利用7对引物和RACE技术得到全基因组全长9530nt，5′UTR包含205nt，3′UTR包含290nt，编码一个多聚蛋白共3010个氨基酸。核苷酸同源分析，MVCV与Plumpoxvirus相似度最高为61.1%，与Sweetpotatomildmottlevirus的相似度最低，为41.2%；核苷酸系统进化分析得出，MVCV与Plumpoxvirus、SweetpotatovirusG、Sweetpotatovirus2聚为一簇，亲缘关系最近。氨基酸同源分析得出，MVCV与Plumpoxvirus的一致性最高达60.4%，与Sweetpotatomildmottlevirus的相似度最低为26.3%；氨基酸进化分析得出，MVCV与Euphorbiaringspotvirus、Tobaccoveinmottlingvirus、Yammosaicvirus、Pokeweedmosaicvirus、PotatovirusA5个病毒聚为一簇，其中与最近的是Euphorbiaringspotvirus，与Sweetpotatomildmottlevirus相距最远。将得的MVCV病毒全长和2651条contigs进行比对，得到共有97条contigs相对均匀的分布在MVCV全基因组上。通过极性分析来自MVCV的vsiRNA，两者差异不大接近1:1，正义链与负义链所占比例分别为51%和49%。5′碱基偏好性A/U大于G/C。1500nt-1800nt和5100nt-5400nt的位置出现siRNA的出现的次数较多，其中5100nt-5400nt处siRNA的数量超过50000条，而且大部分来自正义链。 蜀葵病毒1号全长15516nt，是正义单链RNA病毒，具有长线形病毒属成员的基因组特点，有9个的开放阅读框（ORF），经推导其编码分别编码1a、1b、p7、HSP70h、CPh、CPm、CP、p20和p21。核苷酸同源性分析，与Tobaccovirus1相似度最高为69.1%，其次是Mintvirus1相似度61.8%。核苷酸系统进化分析得出ArV1与Tobaccovirus1和Mintvirus1聚为一簇。用长线形病毒科成员与ArV1病毒的HSP70h氨基酸序列同源性分析，相似度最低的是Grapevineleafroll-associatedvirus4为11.3%，最高是Tobaccovirus1为80.4%，其中与长线形病毒属病毒的同源性为32.1%-80.4%；系统进化分析得到ArV1与Tobaccovirus1和Mintvirus1聚为一簇，亲缘关系最近的是Tobaccovirus1。ArV1病毒全长与2651条contigs进行比对，得到了195条contigs比对上ArV1病毒序列。sRNA的正义链占59.28%，负义链占40.72%。长度为18-24nt小RNA的5′碱基偏好性各不相同，siRNA的5′端以“A”出现次数最多。热点区域集中在3个区域，特别是14500nt-14800nt，产生13500条小RNA。 西瓜花叶病毒是马铃薯Y病毒属成员之一，从蜀葵上扩增得到WMV-Tg全长10026nt。核苷酸同源性分析，与WMV-Tg与其他WMV基因组全序列核苷酸水平上的同源性为83.3%-90.2%，与韩国人参分离物WMV-Pg的相似度最高，为90.2%；与韩国的西瓜分离的WMV-Buan2_2014相似度最低为83.3%；从系统进化关系可以看出WMV-Tg与WMV-Pg，亲缘关系最近。氨基酸的一致性在90.7%-95.8%，与韩国人参分离物WMV-Pg的一致性最高达95.8%；氨基酸系统进化关系与WMV-Pg形成一个独立的分支，亲缘关系最近。将得到的2561个contigs中87条contigs可以与WMV-Tg全序列匹配。18-24ntvisRNA的数量分别是1584、2345、7491、76619、43437、1876和167条。WMV-Tg来源的sRNA的极性分布比例较近1﹕1。小RNA5′端碱基有一个特点U/A占的比例最高。这与植物中产生miRNA5′碱基偏好性一致的，均表现出对A/U碱基有一定的偏好性。WMV的小RNA特异的序列在7000-9000范围内聚集特别多，而其他区域较少。
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