摘要
蓝莓含有丰富的营养物质、微量元素，以及各种活性成分，尤其是高含量的花青素，被联合国粮农组织列为人类五大健康食品之一。流行病学统计显示，食用蓝莓可显著降低患2型糖尿病的风险，这与花青素有助于恢复胰岛素敏感性密切相关，但具体作用机制尚不明确。花青素作为蓝莓的天然色素和功能特征成分，有多种生理功能，如抗氧化、抗炎、抗衰老、降血糖等。Toll样受体4（TLR4）一直被视为参与炎症反应的经典先天免疫识别分子，近期研究发现TLR4有效参与了糖脂代谢调控，并与调节胰岛素抵抗相关，锦葵色素是蓝莓花青素中最重要的成分，兼具抑制炎症和降糖降脂功效，由此可以推测，锦葵色素可能基于TLR4通路发挥作用。本文以蓝莓花青素提取物及其主成分锦葵色素葡萄糖苷、锦葵色素半乳糖苷和锦葵色素阿拉伯糖苷为研究对象，并对蓝莓花青素基于TLR4信号通路抑制肠道炎症和调控糖脂代谢的作用机制进行研究。 主要研究内容以及结果如下： （1）选用野生型C57BL/6J小鼠和敲除TLR4基因的C57BL/10ScNJGpt小鼠，高脂高糖喂养5个月，而后注射链脲佐菌素构造糖尿病小鼠模型，连续灌胃蓝莓花青素提取物5周，每周检测血糖和体重情况，第五周进行糖耐量实验。结果表明，C57BL/6J小鼠比TLR4-/-小鼠的糖尿病造模成功率高，体重和血糖变化更为显著。在C57BL/6小鼠中灌胃低剂量和高剂量蓝莓花青素可以增加糖尿病小鼠体重以及降低血糖水平，这种作用在TLR4-/-小鼠并未显现。通过酶联免疫吸附实验、实时荧光定量聚合酶链反应研究蓝莓花青素是否作用在TLR4来抑制肠道炎症以及调控肝脏的糖脂代谢。结果表明，蓝莓花青素可以抑制C57BL/6J糖尿病小鼠炎症相关信号通路（核因子-kappaB）以及炎症因子（单核细胞趋化蛋白-1、血管细胞粘附分子-1）mRNA转录水平和蛋白水平的表达，作用机制是通过下调TLR4及其结合蛋白髓样分化因子88和下游信号通路肿瘤坏死因子受体相关因子6的mRNA转录水平和蛋白表达水平抑制肠道炎症。蓝莓花青素也可以调控糖代谢相关因子（葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖转运体2、叉头转录因子1）和脂代谢相关因子（乙酰辅酶A羧化酶、3-羟基-3-甲基戊三酰辅酶A还原酶、激素敏感脂肪酶）的mRNA转录水平和蛋白表达水平，作用机制是通过下调TLR4促进下游胞内磷脂酰肌醇激酶-内皮型一氧化氮合酶信号通路激活AMP依赖的蛋白激酶信号通路达到调控糖脂代谢的作用。 （2）以正常的Caco-2细胞以及构建质粒载体、慢病毒感染方式过表达TLR4和短发夹RNA（shRNA）沉默TLR4基因的Caco-2细胞为肠道细胞模型，采用蛋白免疫印迹进行筛选和验证过表达和沉默TLR4细胞的效果。用白细胞介素-1β刺激五种Caco-2细胞诱导炎症，通过酶联免疫吸附实验、实时荧光定量聚合酶链反应研究蓝莓花青素是否作用在TLR4来抑制细胞肠道炎症。蓝莓花青素提取物及其主成分锦葵色素葡萄糖苷、锦葵色素半乳糖苷和锦葵色素阿拉伯糖苷可以抑制正常的Caco-2细胞核因子-kappaB信号通路以及炎症因子（单核细胞趋化蛋白-1、血管细胞粘附分子-1）的mRNA转录水平和蛋白表达水平，作用机制是通过下调TLR4及其结合蛋白髓样分化因子88和下游信号通路肿瘤坏死因子受体相关因子6的mRNA转录水平和蛋白表达水平抑制肠道细胞炎症。在shRNA沉默TLR4基因的Caco-2细胞中，蓝莓花青素抑制细胞炎症效果并不显著；而在TLR4过表达的Caco-2细胞中，蓝莓花青素抑制细胞炎症效果比正常的Caco-2细胞更为显著，证实了TLR4在蓝莓花青素抑制肠道细胞炎症中的关键作用。 （3）以正常的HepG2细胞以及构建质粒载体、慢病毒感染方式表达TLR4和shRNA沉默TLR4基因的HepG2细胞为肝脏细胞模型，并采用蛋白免疫印迹进行筛选和验证过表达和沉默TLR4细胞的效果。用葡萄糖和油酸刺激五种HepG2细胞诱导炎症和糖脂代谢紊乱，通过酶联免疫吸附实验、实时荧光定量聚合酶链反应研究蓝莓花青素是否作用在TLR4来调控糖脂代谢。蓝莓花青素提取物及其主成分锦葵色素葡萄糖苷、锦葵色素半乳糖苷和锦葵色素阿拉伯糖苷可以通过下调TLR4以及糖代谢相关因子（葡萄糖-6-磷酸酶）和脂代谢相关因子（乙酰辅酶A羧化酶）的mRNA转录水平和蛋白表达水平，作用机制是通过下调TLR4促进胞内磷脂酰肌醇激酶-内皮型一氧化氮合酶信号通路，激活AMP依赖的蛋白激酶信号通路达到调控糖脂代谢的作用。在shRNA沉默TLR4基因的HepG2细胞中，蓝莓花青素调控糖脂代谢效果并不显著；而在TLR4过表达的HepG2细胞中，蓝莓花青素调控糖脂代谢效果比正常的HepG2细胞更为显著，证实了TLR4在蓝莓花青素调节肝脏细胞糖脂代谢中的关键作用。 上述结果表明，蓝莓花青素是基于TLR4信号通路抑制肠道炎症以及调控糖脂代谢的。这为利用蓝莓花青素开发靶向调节糖脂代谢的新型功能性食品配料提供了科学依据，为今后运用食品营养干预防治糖尿病等代谢综合征奠定了理论基础。
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