摘要
目的：探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）调控甲状腺相关眼病（TAO）眼眶成纤维细胞（OF）去分化的作用。来进一步揭示TAO患者眼眶脂肪增生及纤维化的机制，以寻找调控TAO发病的作用靶点，为进一步研究TAO的发病机制提供实验基础。 方法：收集2019年12月-2020年8月在天津医科大学眼科医院诊断为甲状腺相关眼病行眼眶减压术的手术病人的眼眶脂肪结缔组织，入组患者T3、T4、TSH等指标正常，并稳定半年以上，共6例，6眼，平均年龄35岁，除甲状腺功能异常外无其他疾病病史。采用组织块法分离培养TAO患者眼眶成纤维细胞（OF）并进行波形蛋白免疫荧光染色鉴定。对TAO眼眶成纤维细胞进行成脂诱导分化并进行油红O染色鉴定。用TNF-α对TAO眼眶脂肪细胞进行干预并观察去分化现象。收集分化及去分化过程中的mRNA及蛋白，根据提取时间，其中mRNA分为以下3组：原代（未分化）；分化末期；去分化末期。蛋白分为以下8组：分化3d;分化6d；分化10d；分化末期；去分化3d；去分化6d；去分化10d;去分化末期，使用实时荧光定量PCR及Westernblot法检测PPARγ、ERK1/2、perilipin1mRNA及蛋白的表达。 结果：成功培养人眼眶成纤维细胞，原代培养第4天可见细胞从组织块边缘爬出，细胞呈梭形或多角形细胞，细胞增殖融合后，呈旋涡状紧密排列，经免疫荧光染色显示波形蛋白染色阳性，经形态学及免疫荧光检测，证实所培养细胞为OF。后对所培养OF进行体外成脂分化诱导,可见部分细胞分化为脂肪细胞，而剩余未分化的细胞只表现为细胞形态由长梭形变为圆形或椭圆形，胞浆内未出现明显脂滴。分化末期油红O染色示有部分细胞胞浆中出现大小不等的红色脂肪滴，证实所培养的细胞中有一部分经体外诱导能分化为成熟的脂肪细胞。TNF-α可使TAO眼眶脂肪细胞发生去分化为成纤维样细胞，随TNF-α干预时间的延长，分化成熟的脂肪细胞逐渐由圆形变为长梭形，脂肪细胞胞浆中脂滴逐渐减小，数量逐渐减少，含有脂滴的细胞数量也逐渐减少，对去分化末期细胞进行油红O染色，与分化末期油红染色结果对比发现，去分化末期细胞胞浆中红色脂肪滴消失，未见明显油红O染料着染。实时荧光定量PCR检测结果显示，分化末期组PPARγ、ERK1、ERK2、perilipin1mRNA相对表达量分别为4.26±0.09、2.01±0.09、3.23±0.10、8.69±0.33，较原代（未分化）组的1.00±0.09、1.05±0.19、1.00±0.10、1.05±0.07明显升高，同时也较去分化末期组的1.06±0.03、1.73±0.04、1.15±0.11、6.27±0.09明显升高，除ERK1外，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。Westernblot检测结果显示的总体变化趋势与RT-PCR检测结果相符。 结论：TNF-α对TAO眼眶成纤维细胞来源的脂肪细胞有去分化作用。推测TNF-α通过影响脂肪细胞分化通路中PPARγ、P-ERK1/2和perilipin1蛋白的表达来影响脂肪细胞的去分化过程。
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