摘要
黏菌素（COL）是一种阳离子多肽类抗菌药物，是治疗多重耐药（MDR）阴性菌感染的最后手段。随着COL的使用日益增多，细菌的COL耐药性问题已经迫在眉睫，对人类的健康构成威胁。近年来，新作用靶点抗菌药物的开发举步维艰，相比之下，寻找抗生素佐剂与抗菌药物联用是更加经济有效的策略。驱虫药氯氰碘柳胺（CST），是一种氧化磷酸化解偶联剂，主要作用于虫体线粒体，抑制线粒体的磷酸化过程，可以作为潜在的COL佐剂。本研究证实了CST对大肠杆菌COL耐药性的逆转作用及其量效关系，并探究CST逆转COL耐药性的分子机制，为临床治疗黏菌素耐药（COL-R）大肠杆菌感染提供科学的理论依据。 CST单独作用抗菌活性较差，而1或4μg/mL的CST与COL联用，可使COL的MIC降低2～32倍，使92.86%的大肠杆菌由耐药转为敏感。棋盘药敏试验结果显示，CST与COL联用对COL-R菌株均为协同作用，FIC值为0.125～0.252；对COL-S菌株表现为相加作用，FIC值为0.500。同时，当2μg/mLCOL存在时，CST的最小逆转浓度（MRC）为0.5～4μg/mL，这与CST单独的MIC相比降低了256～4096倍，表现出良好的协同作用。CST对COL-R大肠杆菌的逆转作用表现出了独特的量效关系。在一定范围内，随着CST浓度的升高，作用越来越强，达到一定程度后，作用不变甚至减弱。在一定浓度下，CST仅与COL产生协同作用，与其他抗生素并未显示出协同作用。时间-杀菌曲线的结果表明，1或4μg/mL的CST与1/2×MICCOL联用，在24h内对COL-R大肠杆菌具有协同作用，而对COL-S大肠杆菌则没有，这也与药敏试验结果一致。耐药性发展研究显示，1或4μg/mL的CST与COL联用，连续传代30天，与COL单独培养相比MIC增加较小或不增加，可以有效抑制细菌耐药性发展。我们进一步构建小鼠腹腔感染模型进行体内试验，结果显示CST与COL联用可以显著提高小鼠的存活率，同时可以显著降低小鼠肝脏、脾脏中的细菌载量，CST与COL联用表现出了良好的体内治疗效果。 本研究进一步从细胞膜通透性、外排泵相关功能以及氧化损伤等方面探究氯氰碘柳胺逆转黏菌素耐药性的分子机制及其量效关系。荧光试验结果表明，CST与COL联用可以显著增强NPN的荧光强度，而PI的荧光强度无明显变化，这表明两药联用可以损伤细胞外膜，使外膜通透性增大，但对细胞内膜无影响。同时，两药联用可以使荧光探针DiSC3(5)的荧光强度显著下降，表明CST与COL联用主要通过干扰pH梯度来破坏质子动力。外排泵活性试验发现，CST与COL联用可使荧光探针EtBr的荧光强度显著增强，且量效关系与表型结果相同，表明两药联用可以有效地抑制外排泵活性，同时也是CST逆转COL耐药性的主要分子机制。同时，质子动力的耗散进一步减少ATP的合成，但高剂量的CST与COL联用使ATP合成增加，这一过程可能与呼吸链的变化有关。氧化损伤也是抗生素作用的重要途径，DCFH-DA的荧光染色可以来观察ROS的变化，CST与COL联用可以诱导ROS过量产生，且量效关系与表型结果相同，表明两药联用可以造成氧化损伤，进而引起细胞死亡，同时也是CST逆转COL耐药性的主要分子机制。 使用RT-PCR技术检测CST与COL联用对质粒介导的COL耐药基因mcr-1表达的影响，两药联合使mcr-1的mRNA相对表达量降低了4.26倍，表明两药联合可以显著降低COL耐药基因mcr-1的相对表达。同时，计算机模拟分子对接进一步探究CST与MCR-1蛋白之间的相互作用关系。结果发现，CST通过氢键与MCR-1上的关键氨基酸残基Lys341和Asp337相互作用，影响MCR-1蛋白空间构象发生改变，抑制MCR-1蛋白的生物活性。 综上所述，CST可以逆转大肠杆菌的COL耐药性，且有其独特的量效关系。两药联合可以通过损伤外膜、抑制外排泵活性以及诱导氧化损伤共同作用逆转大肠杆菌COL耐药性，将分子机制与表型的量效关系相结合，发现抑制外排泵活性和诱导氧化损伤是CST逆转COL耐药性的主要分子机制。同时，氯氰碘柳胺与黏菌素联用还可下调mcr-1的相对表达量，氯氰碘柳胺可以直接与MCR-1蛋白相互作用。总体来说，氯氰碘柳胺是一种有效的黏菌素佐剂，为临床治疗COL-R大肠杆菌感染提供了新的治疗策略，同时也揭示了非抗生素药物与抗生素联用对抗细菌耐药性的巨大潜力。
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