摘要
2-苯乙醇是一种具有玫瑰香味的芳香醇，广泛应用于化妆品、食品和制药领域。现今，生物法合成2-苯乙醇的主要有两条路径，第一种为酶催化或全细胞转化法，主要是以苯丙氨酸为前体经艾利希途径合成，第二种为微生物发酵葡萄糖等碳源经莽草酸途径从头合成。相比于第一种途径，第二种合成途径具有更高的经济优势，但当前产物滴度较低。通过基因编辑技术（例如CRISPR技术）开发能够利用木质纤维素生物质衍生糖的工程菌株可以进一步降低成本，提高该生产途径的竞争力。而在CRISPR/Cas9基因编辑系统中，gRNA引导Cas核酸酶偏好靶向NGG的PAM基序，这限制了该技术的应用。SpRY是在哺乳动物细胞中筛选出的低PAM依赖性Cas9变体，该突变体有助于扩展CRISPR/Cas9的应用范围。 本研究第一部分是考察CRISPR/SpRY系统用于酿酒酵母基因编辑和转录调控的潜力。 首先，在酿酒酵母BY4741菌株中评估CRISPR/SpRY系统对单基因和多基因敲除效率和PAM偏好性。通过靶向敲除ADE2基因，发现几乎各种gRNA和PAM（NNN）的组合均有编辑活性，其中NAN最优敲除效率达97.39％,与CRISPR/Cas9系统在NGG位点效率相当，PAM偏好性为:NAN＞NGN＞NYN（Y为C/T）。同时靶向ADE2和CAN1基因的双基因敲除效率可达到54.73％,均低于其单敲除效率。然后，利用CRISPR/SpRY系统靶向三个负责葡萄糖磷酸化基因（GLK1、HXK1和HXK2）的单独和组合敲除，GLK1、HXK1和HXK2的单敲除效率分别为93.33％、96.67％和13.33％,三基因共敲除效率为6.67％。表明CRISPR/SpRY能够用于酿酒酵母的多重基因编辑。 然后，通过失活SpRY的核酸酶活性并融合抑制转录因子Mxi1构建了CRISPR/dSpRY-Mxi1转录调控系统。通过设计gRNA靶向表达红色荧光蛋白的外源启动子sbay.TDH3p的不同位置，发现dSpRY-Mxi1对荧光强度的抑制效率与gRNA的靶向位置相关，转录抑制程度在距离报告基因起始密码子上游100-250bp处最佳，其中gSbT3具有最大下调了34.97％的荧光强度。 本研究第二部分构建了从头合成2-苯乙醇的木糖发酵酿酒酵母，通过解除负反馈抑制、阻断副产物合成和增强限速酶的组合代谢工程策略，通过优化底物组成和分批补料发酵的过程工程，将2-苯乙醇产量提高了2.03倍。 首先，在酿酒酵母BY4741菌株中组合过表达木酮糖激酶和非氧化戊糖磷酸途径基因并敲除限制木糖代谢的基因(ISU1、HOG1和PHO13）获得一株木糖发酵底盘菌株LSC102（BY4741gre3∷XKS1-PPPΔISU1ΔHOG1ΔPHO13),其在引入木糖异构酶表达质粒后能有效同化木糖。然后，通过原位引入ARO3K222L、ARO4K229L和ARO7G141S点突变解除莽草酸途径的负反馈抑制、原位突变丙酮酸激酶PYK1D146N并敲除ARO8和EAT1以弱化副产物途径，得到提升2-苯乙醇产率的菌株LSC106。进一步对莽草酸和艾利希途径的限速酶进行单独或组合过表达，发现PHA2-ARO10共表达菌株可生产378.14mg/L的2-苯乙醇。随后，调节碳源组成发现葡萄糖-木糖混合糖更有利于2-苯乙醇合成，在5g/L葡萄糖和15g/L木糖混糖培养基（D5X15）中，PHA2-ARO10共表达菌株摇瓶发酵2-苯乙醇滴度提高至646.15mg/L,这是20g/L葡萄糖中452.74mg/L的1.43倍。最后，通过分批补料发酵可将PHA2-ARO10共表达菌株在葡萄糖中的2-苯乙醇滴度提高至580.97mg/L,但在混合糖中产量未进一步提高。 本研究表明低PAM依赖的CRISPR/SpRY系统可用于酿酒酵母的多重基因组编辑和转录调控，拓展了酿酒酵母可用的CRISPR工具。发现葡萄糖和木糖混合底物更有利于木糖发酵酵母从头合成2-苯乙醇，为开发利用木质纤维素生物质生产2-苯乙醇的工业菌株奠定了基础。
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