摘要
背景： 糖尿病是全球最常见的非传染性疾病之一，患病率逐年升高，长期血糖控制不佳，微血管和大血管病变风险增加，引起全身多器官功能障碍，导致生活质量下降及预期寿命缩短。糖尿病足溃疡(Diabeticfootulcer,DFU)是糖尿病患者最常见的慢性并发症之一，超过15%的糖尿病患者预计会在其一生中发生DFU，尤为严重的是，DFU具有较高的截肢率且超过一半的截肢患者将在5年内死亡。危险因素广泛、足部解剖结构复杂、病理改变涉及多组织器官等共同导致DFU治疗充满挑战。DFU迁延不愈，长期治疗过程中产生巨大的医疗费用，给家庭和社会带来了巨大的经济负担。早期筛查规范治疗、发现新的治疗靶点促进创面愈合在DFU治疗中具有重大的意义。 表观遗传是生物界普遍现象，可以调节基因表达参与组织修复等生物学过程。作为表观遗传的一种媒介，微小RNA(microRNA,miRNA)是目前研究最广泛的非编码RNA(ncRNA)，其长度约为18-25个核苷酸，它通过与特定信使RNA(mRNA)的3''非翻译区(3’untranslatedregion，3''UTR)结合来抑制基因表达从而发挥调节作用。miRNAs在创面愈合中的重要作用已被广泛报道。既往研究表明miRNA-221-3p可参与调节宫颈癌细胞迁移和侵袭，脂肪细胞脂质代谢及肺动脉平滑肌增殖等，而miRNA-221-3p关于创面愈合很少报道。本课题组的前期研究发现miRNA-221-3p可显著促进正常及糖尿病小鼠创面愈合，然而，miRNA-221-3p在促进创面愈合过程中的作用机制仍然未知，有待进一步阐述。 通过转录组测序结果结合生信分析，预测发现双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)是miRNA-221-3p的靶基因。DYRK1A是具有双磷酸化活性的激酶，可作用于广泛的底物，参与增殖、凋亡、代谢、炎症等多种细胞过程以及神经退行性疾病、肿瘤、糖尿病等多种疾病，但它在糖尿病足溃疡中未见报道。 目的： 通过细胞实验、miRNA-221敲除动物及糖尿病足溃疡标本，探索miRNA-221-3p通过靶向DYRK1A促进糖尿病创面愈合的分子机制。 方法： 第一部分：合成miRNA-221-3pagomir注射在正常及糖尿病小鼠创面边缘皮肤，在不同时间点取材探究miRNA-221-3p对创面边缘皮肤病理生理改变的影响，锁定具体作用途径。具体通过拍摄创面愈合图片计算创面愈合统计率明确miRNA-221-3p对创面愈合的影响；免疫组化检测不同分组糖尿病小鼠创面边缘皮肤免疫细胞浸润；RT-qPCR检测不同分组小鼠创面边缘皮肤IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达变化。 第二部分，选择与相关作用途径密切相关的人角质形成细胞(HaCaT)行体外实验，筛选miRNA-221-3p发挥作用的具体靶基因及作用通路，探究miRNA-221-3p促进创面愈合的分子作用机制。具体通过采用高糖培养HaCaT细胞模拟糖尿病的高糖环境，采用miRNA-221-3pmimic过表达miRNA-221-3p及DYRK1A的siRNA抑制DYRK1A表达，通过RT-qPCR检测炎症因子的改变；通过流式细胞学检测miRNA-221-3p对人中性粒细胞趋化性影响；通过二代高通量测序及双荧光素酶实验验证miRNA-221-3p的靶基因及作用通路；通过免疫蛋白印迹实验验证miRNA-221-3p及DYRK1A对STAT3信号通路的影响；通过免疫荧光实验验证miRNA-221-3p对高糖诱导的STAT3核移位的影响。 第三部分，繁育miRNA-221基因敲除小鼠，验证miRNA-221-3p对创面愈合的重要性并验证靶基因及相关通路的改变。具体通过拍摄创面愈合图片计算创面愈合统计率明确miRNA-221敲除对创面愈合的影响；免疫组化及免疫蛋白印迹实验检测不同分组糖尿病小鼠创面边缘皮肤靶基因DYRK1A的表达差异及miRNA-221敲除对STAT3信号通路影响。 第四部分，最后选取正常血糖人群创面边缘皮肤及糖尿病患者足部溃疡边缘皮肤进行对比，回归临床验证靶基因及相关通路的改变。具体通过免疫组化及免疫蛋白印迹实验检测正常及糖尿病患者创面边缘皮肤靶基因DYRK1A及STAT3信号通路表达差异。 结果： (1)miRNA-221-3p显著促进正常及糖尿病小鼠皮肤创面愈合速度；(2)miRNA-221-3p可抑制糖尿病小鼠创面边缘炎症细胞浸润及免疫细胞趋化；(3)miRNA-221-3p靶向DYRK1A调节STAT3磷酸化，从而抑制高糖环境引起的HaCaT炎症反应；(4)miRNA-221敲除糖尿病小鼠创面边缘皮肤免疫细胞浸润增多，创面愈合减慢；(5)糖尿病足溃疡患者创面边缘皮肤中DYRK1A/STAT3信号通路异常激活。 结论: miRNA-221-3p通过抑制DYRK1A/STAT3信号通路对角质形成细胞的炎症反应起关键作用，miRNA-221-3p的缺乏可能导致2型糖尿病慢性创面的持续炎症和愈合受损，miRNA-221-3p有望成为糖尿病创面愈合的新的潜在疗法。
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