摘要
三七(Panaxnotoginseng)为五加科传统名贵中药材，其主要药用成分为三萜皂苷类物质。这些物质通过MVA和MEP两个代谢途径，经过系列关键酶基因作用而合成。本研究根据茉莉酸甲酯处理的三七不定根转录组分析，筛选可能与三萜皂苷合成相关的糖基转移酶基因:PnUGT6350、PnUGT3498和PnUGT4291,通过分析它们的生物信息学，及转基因过表达等方式研究其在三萜类物质合成中的作用。具体研究结果如下: 1、从茉莉酸甲酯处理的三七不定根转录组数据中筛选得到与三萜类物质合成相关的3个糖基转移酶基因，分别为PnUGT6350、PnUGT3498和PnUGT4291,属于UGT73和UGT74家族，预测修饰位点为C3。以三七不定根cDNA为模板，克隆PnUGT6350、PnUGT3498和PnUGT4291基因,其碱基长度分别为:1482bp、1431bp和1368bp,分别编码493、476和455个氨基酸。生物信息学分析显示:三个糖基转移酶蛋白均属于亲水性蛋白，不含有跨膜结构域，不存在信号肽，含有糖基转移酶的保守结构域，属于糖基转移酶家族。分析PnUGT6350、PnUGT3498和PnUGT4291基因在三七不定根主根、不定根侧根、组培苗根、叶柄、叶片不同组织部位的特异性表达情况,结果表明三个基因在所检测的5个组织部位均有表达，PnUGT6350和PnUGT3498基因在不定根主根中的表达水平均显著高于其它部位，PnUGT4291基因在叶片中的表达水平最高。 2、成功构建了pROKII-PnUGT6350、pROKII-PnUGT3498和pROKII-PnUGT4291植物表达载体。利用叶盘转化法将pROKII-PnUGT6350和pROKII-PnUGT3498基因转入烟草中，并获得转PnUGT6350基因烟草8个株系，其中表达量最高的是10号和14号株系;转PnUGT3498基因烟草10个株系，其中表达量较高的株系是4号和5号。对上述4个表达量较高的转基因烟草株系，进行齐墩果酸前体饲喂，提供糖基转移酶修饰底物，分析其作用的产物金盏花苷E,结果显示转PnUGT6350基因的烟草10号和14号产生了金盏花苷E且含量较高，而转PnUGT3498基因的烟草4号和5号未检测到金盏花苷E。 3、建立了三七不定根瞬时转化体系，将PnUGT6350、PnUGT3498和PnUGT4291基因瞬时转入三七不定根中。测定了转PnUGT6350基因不定根中金盏花苷E、R1、Rg1、Re和Rb1五种皂苷的含量，分别是对照含量的1.38倍、1.75倍、2.42倍、1.72倍和2.29倍;测定转PnUGT4291基因不定根中金盏花苷E、R1、Rg1、Re、Rb1的含量，其中R1、Rg1、Rb1分别是对照中含量的1.56倍、2.04倍和1.83倍;金盏花苷E和Re含量未有明显变化;转PnUGT3498基因不定根中金盏花苷E、R1、Rg1、Re和Rb1的含量，分别是对照含量的1.27倍、1.23倍、1.64倍、1.30倍、1.79倍。建立了三七不定根稳定遗传转化体系，成功将PnUGT6350和PnUGT3498基因转入三七不定根中,获得转PnUGT6350基因三七20个不定根系，转PnUGT3498基因三七8个不定根系。
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