摘要
中华鳖（Pelodiscussinensis）是我国特有的淡水养殖物种，极具食用及药用价值，近年来随着中华鳖人工养殖规模扩大，各种养殖问题也随之而来。2020年江西南丰县中华鳖养殖场出现爆发性死亡，经课题组前期研究，已鉴定出爆发性疾病病原菌为维氏气单胞菌，并通过体外抑菌实验筛选出中草药白蔹提取物对该菌有抑制作用。本研究通过维氏气单胞菌侵染中华鳖，对中华鳖脾脏组织进行转录组测序，筛选免疫相关的基因和通路，探究维氏气单胞菌对中华鳖的致病机理。进一步通过不同浓度的白蔹提取物对鳖源维氏气单胞菌进行体外抑菌和杀菌试验，挑选最佳浓度并探究其对维氏气单胞菌的生长影响和毒力基因的抑制作用；通过在中华鳖日粮中添加白蔹提取物，检测脾脏的组织病理变化、非特异性免疫功能和免疫因子分泌以及免疫相关基因的表达变化情况，以期为白蔹提取物作用于中华鳖缓解维氏气单胞菌感染的药理机制提供理论基础。具体研究结果如下： 1.维氏气单胞菌感染中华鳖脾脏转录组分析 本实验通过维氏气单胞菌攻毒实验，对中华鳖脾脏组织进行转录组测序，共得到28.6GbCleanData，Q20碱基百分比大于97.78%。以中华鳖基因组作为参考基因组进行比对，各样品比对效率大于80%，在83.37%~86.14%之间。实验组和对照组脾脏进行比较共得到1603个差异基因（DEGs），其中902个差异基因上调，701个差异基因下调。通过GO数据源库进行功能富集分析发现，各差异基因在生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）中均有分布，包括ATP酶活性（GO:0016887）、细胞外的外来体（GO:0070062）、质膜的组成部分（GO:0005887）等；在功能富集与免疫刺激相关的二级节点中筛选到趋化因子受体3（CXCR3）、白细胞介素6（IL6）、肿瘤因子受体超家族成员6B（TNFRSF6B）等差异基因。通过KEGG数据库富集分析发现，在富集的TOP20的信号通路中有吞噬体、细胞因子-细胞因子受体交互作用、Toll样受体信号通路等6条与免疫密切相关的通路。 2.白蔹提取物对鳖源维氏气单胞菌的体外抑制效果 通过牛津杯法和二倍稀释法检测中草药白蔹提取物对维氏气单胞菌抑菌圈、MIC（最小抑菌浓度）、MBC（最小杀菌浓度）和生长曲线的影响。结果显示维氏气单胞菌对300mg/mL的白蔹提取物药液中度敏感，抑菌圈直径：13.66±0.14mm，MIC为：75mg/mL，MBC为：100mg/mL；选取MIC75mg/mL的白蔹提取物药液进行鳖源维氏气单胞菌生长实验抑制观察，相对于呈“S”型生长的对照组来说，实验组细菌在5h前未生长，5h后缓慢生长，菌株浓度明显小于对照组，有明显的抑菌效果。以对照组细菌的cDNA作为模板对exu（核酶）、ast（热稳定性肠毒素）、ser（丝氨酸蛋白酶）、aer（气溶素）、act（毒性肠毒素）、alt（热不稳定性肠毒素）、fla（鞭毛蛋白）、lip（脂肪酶）等8种毒力因子进行PCR检测，结果显示此次鳖源维氏气单胞菌含exu、ast、aer、act和fla五种毒力因子；用白蔹提取物的最小抑菌浓度作用于维氏气单胞菌，使用qRT-PCR对毒力基因进行定量表达分析，结果显示与对照组相比，实验组的exu和ast无表达，aer、act和fla毒力基因极显著下调（P＜0.01），表明白蔹提取物能够使鳖源维氏气单胞菌的毒性大幅降低，有较好抑菌作用。 3.白蔹提取物对中华鳖抗维氏气单胞菌感染研究 为进一步了解白蔹提取物作用于中华鳖后对机体免疫功能的影响，将0mg/kg、750mg/kg、1000mg/kg、1250mg/kg的白蔹提取物添加到基础日粮中饲喂中华鳖，进行维氏气单胞菌感染实验，结果显示1250mg/kg实验组的中华鳖存活率最高为80%。并以此浓度进一步实验，将养殖中华鳖分为A组（对照组）、B组（白蔹提取物组）、C组（维氏气单胞菌组）和D组（白蔹提取物＋维氏气单胞菌组）四组，得到以下结果： （1）维氏气单胞菌感染后C组存活率为40%，而D组存活率为80%，表明白蔹提取物能够显著提高中华鳖感染维氏气单胞菌后的存活率。平均增重率（WGR）和平均特定生长率（SGR）中显示B组＞A组＞C组（P＜0.01），D组＞C组（P＜0.01），A组和D组无显著性差异。C组脾脏指数显著高于A、B、D组（P＜0.05）；D组中脾脏载菌量显著低于C组（P＜0.05）。 （2）组织病理学观察发现，A、B组中华鳖脾脏组织在养殖期间健康无异常，各组织结构正常无病变。而C组在攻毒后的第1-7d有明显的的病变，出现坏死性炎症，主要表现为大量红细胞浸润，血细胞核变性、变形坏死，红髓和白髓无法区分，淋巴细胞减少，细胞核固缩、碎裂、溶解，出现单核细胞、中性粒细胞、浆细胞等大量炎症细胞和含铁血黄素沉着，导致细胞坏死。D组脾脏组织损伤有所恢复但仍有炎症细胞浸润，第1-3d时各细胞也存在颗粒变性和坏死现象，红髓白髓可区分清楚亦有炎症细胞和少量含铁血黄素沉着；但在饲养的第5-7d时只存在少许含铁血黄素沉着和稍多的红细胞，相较于前期和C组有明显恢复。TUNEL法检测各组中华鳖脾脏组织中的细胞凋亡，结果表明C组中华鳖脾脏组织细胞凋亡水平极显著上升（P＜0.01），存在明显的细胞凋亡信号。相较于C组，D组脾脏细胞凋亡水平明显降低（P＜0.01），但也有少许细胞凋亡信号。 （3）酶活力结果显示，饲喂22d后中华鳖血清和脾脏中，A和B组髓过氧化物酶（MPO）的活力无显著变化（P＞0.05），C组＞D组＞A组（P＜0.01）；血清和脾脏中总抗氧化能力（T-AOC）活力变化：B组＞A组＞D组＞C组（P＜0.01）；血清中酸性磷酸酶（ACP）变化为：B组＞A组（P＜0.05），A组＞D组＞C组（P＜0.01），脾脏中ACP变化为：B组＞A组＞D组＞C组（P＜0.01）；血清和脾脏中碱性磷酸酶（AKP）活力变化：B组＞A组＞D组＞C组（P＜0.01）。 （4）ELISA检测脾脏组织中炎症因子的分泌水平，结果显示：饲喂至第22d，四组中脾脏的TNF-α表达水平变化为：C组＞D组＞A组＞B组，（P＜0.01）；IL-10表达水平为：B组＞A组＞D组＞C组（P＜0.01）；IL-6表达水平为：C组＞D组＞A组（P＜0.01），A组＞B组（P＜0.05）。 （5）根据转录组筛选到的免疫基因进行实时定量分析发现，饲喂到22d，与A组相比，B组中华鳖CXCR3、IRF7的表达极显著上调（P＜0.01），IL6极显著下调（P＜0.01），TNFRSF6B显著下调（P＜0.05），SOCS3无显著差异；C组中华鳖CXCR3、IRF7极显著下调（P＜0.01），IL6、TNFRSF6B和SOCS3极显著上调（P＜0.01）；D组中华鳖IRF7显著上调（P＜0.05），IL6、TNFRSF6B和SOCS3极显著上调（P＜0.01），CXCR3无显著差异。相较于C组，饲喂白蔹提取物的D组的CXCR3和IRF7的表达量极显著上调（P＜0.01），IL6、TNFRSF6B和SOCS3的表达量极显著下调（P＜0.01）。 综上所述，本研究通过转录组学、组织形态学、分子生物学等研究手段，并结合体外和体内实验，发现饲喂1250mg/kg白蔹提取物能有效提高中华鳖的存活率、减轻脾脏组织病理损伤、激活免疫反应，增强中华鳖机体免疫功能、抗维氏气单胞菌感染能力，可作为生产养殖上治疗维氏气单胞菌感染的抗生素代替物。
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