摘要
鸡大肠杆菌病是造成鸡养殖业经济损失的主要细菌性疾病之一，禽致病性大肠杆菌是引起鸡大肠杆菌病的主要病原。大肠杆菌致病力与其包含的毒力基因个数及种类密切相关。我国临床上多用抗生素对鸡大肠杆菌病进行防治，但大量不合理地使用抗生素使细菌耐药情况严重，现今在我国禁抗、限抗背景下，筛选一种有效抑菌产品尤为重要。噬菌体是细菌的天敌，其发现早于抗生素，一经发现即用于细菌疾病的治疗，抗生素的发现使人们逐渐将其忽略，随着细菌耐药情况的愈加严重，噬菌体疗法再度进入人们视野。 1.对实验室保存的334株大肠杆菌进行毒力基因检测，筛选致病大肠杆菌菌株进行药敏检测，结果显示，在334株大肠杆菌中，筛选出禽致病性大肠杆菌菌株有83株。耐药检测结果显示，83株大肠杆菌中，对21种抗生素耐药率在100%的菌株有12株，占比14.5%；耐药率在90-99%的菌株有10株，占比12.0%。 筛选出耐药率在90%以上的致病性大肠杆菌为宿主菌进行噬菌体分离，对分离所得的噬菌体进行生物学特性检测。共分离11株噬菌体，挑选三株噬菌体进行试验，并将其命名为Bp4、Bp23、Bp26，三株噬菌体噬菌斑大小分别为1.2-1.5mm、1.5-2mm、2-2.2mm。对三株噬菌体进行裂解谱检测，结果显示，Bp4可裂解83株大肠杆菌中的12株，Bp23可裂解3株，Bp26可裂解2株。选择Bp4进行生物学特性检测，最佳感染复数结果显示，Bp4最佳感染复数为0.01；一步生长曲线结果显示Bp4潜伏期为20-30min，裂解期为30-50min，50min以后为Bp4的平台期；噬菌体Bp4热稳定性及酸碱耐受性结果显示，40-60℃条件下温育60min噬菌体效价没有明显降低，70℃温育30min时噬菌体Bp4效价即有明显降低，但孵育60min后仍有少量噬菌体存活，80℃温育30min噬菌体即全部灭活；噬菌体Bp4酸碱度耐受情况检测结果可知，其最适pH为7，在pH小于3大于11的环境下将噬菌体孵育2h后，噬菌体活性全部丧失；体外抑菌效果检测结果显示，对照组增长期大肠杆菌在8h内菌液浓度均明显大于噬菌体作用组，且在5h内，大肠杆菌菌液浓度几乎没有明显升高；将对数期大肠杆菌菌液与Bp4溶液等量混合共培养5h后，MOI为1与0.01的噬菌体作用组OD值明显低于大肠杆菌对照组，且噬菌体作用组OD值较培养前明显降低。 对噬菌体保存方法进行初步探索，使用四种方法在三个温度环境下保存，结果显示，4℃环境中，四种方法在短时间内保存效果相当，但若长期保存，采用7%浓度的DMSO保存效果最好；在﹣20℃环境下，四种保存方法之间保存效果相差不大；﹣80℃环境下，各种保存方法的保存效果差别较大，浓度为20%甘油保存法在60d后噬菌体效价即表现出大幅下降，7%DMSO加20%甘油混合保存法损失效价在一个数量级之内；将三个温度下四种方法的保存效果进行对比，短时间内，各个方法的保存效果相差不大，但若需长期保存，尽量选择7%DMSO加20%甘油混合保存法保存于﹣80℃环境中。 2.使用噬菌体Bp4的宿主菌建立动物模型，用预试验所得的攻毒途径及攻毒剂量进行攻毒，对攻毒后雏鸡进行临床症状观察，剖检观察器官病变，采血对菌血浓度进行检测，同时对致病菌进行分离鉴定，对病变器官进行病理切片观察。结果显示在攻毒后12h到24h，攻毒鸡群出现临床症状；攻毒60h到72h后，临床症状基本消失。菌血浓度显示，在攻毒后12h血液内细菌浓度达到最高。致病菌分离鉴定结果显示分离得到的大肠杆菌可被Bp4裂解。器官病变观察发现，攻毒24h后肝脏表面出现出血点，肺脏充血出血严重，个别雏鸡肠道内充满气体；攻毒36h后剖检可观察到器官粘连严重；攻毒后60小时剖检，即发现症状出现好转。病理切片发现，攻毒后36h时出现明显病理变化。 3.对噬菌体Bp4防治效果及安全性进行研究，在攻毒前后对雏鸡使用噬菌体溶液，检测噬菌体对大肠杆菌病的预防及治疗效果，并对雏鸡肌肉注射最大浓度噬菌体原液，检测噬菌体溶液安全性。结果显示，感染大肠杆菌后3h内皮下注射噬菌体溶液能有效控制疾病发生，在感染后5h内进行皮下注射噬菌体溶液仍呈治疗效果，且能有效控制病程，减轻雏鸡临床症状；在攻毒前5h内皮下注射噬菌体能有效预防大肠杆菌的发生。对安全性效果研究结果显示，注射噬菌体溶液雏鸡未出现临床症状，解剖未发现病变。 本试验对鸡致病性大肠杆菌进行筛选，选择毒力较强、耐药严重的大肠杆菌为宿主菌分离噬菌体，对噬菌体各项生物学特性进行检测，成功建立了噬菌体宿主菌的动物模型，并对噬菌体治疗预防效果进行研究，为噬菌体临床使用奠定基础。
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