摘要
研究背景与目的 心肌梗死是一种致命性心血管疾病，全球范围内每年均有数以百万计的死亡病例，其发病率、死亡率居高不下。研究认为炎症反应、细胞凋亡、纤维化等生理病理过程在心肌梗死患者的生存及预后等方面扮演重要角色。长链非编码RNA是一种不具编码功能长度大于200个核苷酸的分子，在细胞的增殖、细胞的分化和凋亡等过程起着重要作用。研究发现在心脏中，lncRNA通过转录调控、转录后基因调控、竞争内源性RNA,蛋白质翻译调控，参与心脏的发育、分化、心肌梗死以及梗死后心肌纤维化、心脏重构和心力衰竭等过程。但是lncRNA在心肌梗死后心肌细胞凋亡中的作用还未得到足够重视，因此本研究将通过高通量RNA测序分析心肌梗死中差异表达的lncRNA,并通过生物信息学、共表达网络分析及荧光定量PCR实验分析差异性表达lncRNA的潜在功能。 研究内容与方法 1、采用结扎左前降支动脉建立SD大鼠心肌梗死模型。采用高通量测序筛选心肌梗死组大鼠心肌细胞与假手术对照组大鼠心肌细胞之间存在差异的LncRNA93358并进行RT-PCR验证。 2、高通量RNA测序选出在AMI大鼠心肌组织中存在差异表达的LncRNA93358,通过miRDB网站预测LncRNA93358可能与miR-34a-3p,miR-125b-2-3p,miR-466c-3p存在互相作用，心肌疾病相关的基因同时预测与这些miRNA存在互作的基因有SLC8A1和TRPS1。采用MS2-RIP实验与双荧光素酶实验验证与LncRNA93358存在互作关系的miRNA和靶基因。 3、在动物水平上探索LncRNA93358促进大鼠心肌梗死后细胞凋亡的可能分子机制。心脏超声检测心脏结构与功能，TTC染色检测心脏梗死程度，HE染色检测心肌细胞病理，TUNEL检测心肌细胞凋亡。包装LncRNA93358敲除慢病毒，qPCR和WB检测Bax、Bcl-2和SLC8A1等基因的相关表达量。 结果 1.高通量RNA测序筛选出241个差异lncRNA（筛选标准:|log2Foldchange|＞1,P＜0.05）,其中上调的有111个，下调的有130个。根据测序结果挑选出与心肌梗死凋亡相关的一种新型上调LncRNA93358,它在AMI大鼠的心脏组织中的表达水平比假手术对照组提高了7倍。通过RT-PCR验证了LncRNA93358在AMI组梗死心肌组织中呈高表达。 2.MS2-RIP后进行RT-PCR检测。结果显示，在转染了LncRNA93358-12*MS2的细胞中，发现LncRNA93358表达显著上调。RIP检测到miR-466c-3p,miR-1306-5p的扩增效率较高,miR-466c-3p和miR-125b-2-3p的表达量显著高于MS2组结果可信。推测这两个miRNA和LncRNA93358存在相互作用。同时检测到了SLC8A1的表达。推测LncRNA93358与miR-466c-3p、miR-125b-2-3p和miR-466c-3p、miR-125b-2-3p与SLC8A1可能存在互作关系。双荧光素酶检测到WT-SLC8a1+miR-466c-3p组与WT-SLC8a1组和WT-SLC8a1+mimicNC组相比荧光值显著下降。当把结合位点突变后，荧光值与WT-SLC8a1组和WT-SLC8a1+mimicNC组相比没有显著差异。结果说明SLC8a1与miR-466c-3p存在互作关系，miR-466c-3p能靶向结合SLC8a1。 3.大鼠心脏超声结果显示，与Model组和NC组相比，shRNA组中IVSs显著增大。与NC组相比,shRNA组的LVIDs减少。与Model组和NC组相比,shRNA组LVPWd显著减少;与对照组相比Model组的LVPWd显著增加。与对照组比，Model组左心室EF、FS显著减少;与Model和NC组相比，shRNA组左心室EF、FS显著升高。HR心率，CO心输出量在各组中差异不显著。TTC染色、HE染色和TUNEL检测结果显示模型组有心肌大面积坏死，造模成功;而干扰LncRNA93358后有助于减少心肌梗死的面积。模型组中LncRNA93358和Bax的表达量显著升高，Bcl-2的表达量显著下降。干扰LncRNA93358后，LncRNA93358和Bax表达量下降，Bcl-2和SLC8A1的表达量升高，梗死面积减少，细胞凋亡减少。 结论 干扰LncRNA93358可以抑制大鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡并促进SLC8A1的表达。
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