摘要
研究背景和目的： 近几年肿瘤的免疫治疗发展迅速，其中免疫检查点抑制剂已成为肿瘤治疗领域的热点，并且在多种肿瘤的治疗中，取得了非常好的疗效。然而，随着ICIs在临床全面的应用，由此产生的免疫相关不良事件也逐渐引起了人们的关注。这些免疫相关不良事件主要包括皮肤、肺脏、内分泌、血液、消化系统等，其中免疫检查点抑制剂肺炎（checkpointinhibitorpneumonitis,CIP）是ICI相关毒性的一种。免疫相关的不良反应具有独特的特征，包括特定器官的倾向性、没有剂量依赖的相关性以及潜在的迟发性。本研究以小鼠放射加PD-1抗体免疫治疗的肺部损伤模型深入地探索放射治疗联合anti-PD1治疗造成的肺损伤的机制，希望能对临床的治疗有新的启发。 研究方法： 选取6-8周C57BLl6雄性小鼠40只，随机分为4组：①IgG对照组（IgGgroup）；②anti-PD-1抗体组(aPD-1group)③肺照射组（LR+IgGgroup）；④anti-PD-1抗体联合肺照射组（aPD-1+LRgroup）。通过HE染色，观察小鼠肺组织的病理变化。通过Immuneblotting方法，验证各组小鼠血清中是否含有能结合小鼠肺蛋白的自身抗体。免疫荧光等方法观察有肺损伤的小鼠是哪种自身抗体与肺组织细胞蛋白结合。通过Elisa、rt-PCR、流式细胞术等方法，研究各组TGF-β、TNF-α、IL-6、IL-17、STAT3、STAT6等细胞因子和转录因子的变化。同时通过清除小鼠体内B细胞，阻断自身IgG抗体的产生，确定是否可以改善肺组织的损伤。 结果： 1、2周后，aPD-1+LRgroup小鼠肺组织出现轻度充血、出血，肺间质中也出现少量红细胞渗出，肺泡壁、血管内皮存在破坏，肺泡腔、细支气管内有少量的炎症细胞浸润。4周后，aPD-1+LRgroup组小鼠肺泡间隔断裂、肺泡大量融合、部分可见塌陷、肺泡壁增厚、大量炎性细胞浸润等肺损伤的表现。而其余的三组未出现类似的肺损伤的表现。 2、Immuneblot结果显示：2周时，aPD-1+LRgroup的各个条带较深，明显比其余三组要深，aPD-1+LRgroup小鼠的血清中存在自身抗体IgG抗体，并且此IgG抗体可以特异性地与肺蛋白结合。4周时，aPD-1+LRgroup的各个条带更深，与其余三组比较，差异更大。 3、免疫荧光结果显示，2周时aPD-1+LRgroup组小鼠受损的肺泡上皮细胞周围有很多的IgG荧光沉积，而4周时IgG荧光沉积更加明显。而其余三组，并未看到类似的IgG荧光沉积。而IgM则在2周和4周时，各组均无大量沉积，考虑与IgM关系不明显。 4.Elisa和rt-PCR结果显示，2周时，aPD-1+LRgroup小鼠TGF-β、TNF-α的水平较其余三组均明显升高，且差异有统计学意义，而aPD-1组与IgG对照组以及LR+IgG组与IgG组小鼠组区别均不大；4周时，aPD-1+LRgroup组小鼠的TGF-β、TNF-α较2周时更高，与其余三组差异明显，有统计学意义。LR+IgG组与IgG组比较TGF-β、TNF-α也均升高，且差异有统计学意义。 5.rt-PCR结果显示，aPD-1+LRgroup组小鼠的CD19、CD20以及T-bet和STAT3转录因子均在2周和4周时，明显高于其余三组（P＜0.05），而aPD-1group与IgGgroup以及LR+IgGgroup与IgGgroup小鼠组区别均不大。aPD-1+LRgroup组小鼠的转录因子STAT-6均在2周和4周时，明显高于其余三组（P＜0.05）。aPD-1group与IgGgroup相比，STAT-6明显升高（P＜0.05）。aPD-1+LRgroup小鼠的IL-6、IL-17也明显高于其余三组（P＜0.05），同时，aPD-1group与IgGgroup以及LR+IgGgroup与IgGgroup相比，也明显升高，且均有统计学差异（P＜0.05）。 6.小鼠注射antiCD20抗体后B细胞在小鼠肝脏、淋巴结、脾脏、外周血中均可维持较低状态，且在各类器官中的下降比例是不一样的，而且都在随着时间的变化而变化。清除B细胞后阻断自身IgG抗体的产生，进一步可以明显改善放射联合anti-PD1抗体对肺组织的损伤。 结论： 单纯6Gy肺照射或单纯抗PD-1治疗，并没有引起肺损伤。但放射联合anti-PD1抗体，可以引起明显的肺损伤。在小鼠的血清可以检测到能够与肺蛋白特异性结合的IgG抗体。且免疫荧光显示，小鼠的肺组织中有大量的IgG免疫沉积。进一步研究发现IL-6在aPD-1+LRgroup明显升高，IL-6可通过STAT3传递B细胞增殖信号。同时STAT6及TGF-β也明显升高，在进一步促使肺纤维化过程中发挥重要作用。而清除B细胞后阻断自身IgG抗体的产生，进一步可以明显改善放射联合anti-PD1抗体对肺组织的损伤。
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