摘要
兰科菌根真菌主要定殖于兰科植物的根部皮层细胞中，可为兰科种子萌发和植物的生长发育提供营养物质。目前兰科菌根真菌的促生及定殖机制尚不明确，因而研究兰科菌根真菌与植物的共生机制，对珍稀兰科植物的保护以及药用兰科植物的大规模培养具有重要意义。本研究以铁皮石斛为实验材料，分离兰科菌根真菌，探究菌根真菌对铁皮石斛生长发育的影响以及菌根真菌的定殖机制。实验结果如下: (1)以铁皮石斛根为实验材料，进行内生真菌分离。按照形态学特点、产色素能力进行初步分类，共得到18株真菌。利用ITS序列进行分子鉴定。 结合测序结果及形态学特点对真菌进行鉴定，获得16种真菌，分别为Trichodermasp.、Diaporthesp.、Penicilliumoxalicum、Talaromycesruber、Talaromycesamestolkiae、Fusariumsp.、Paraboeremiasp.、Trichodermasp.、Sordariomycetessp.、Trichodermaasperellum、Fusariumsolani、Chaetomiumsp.、Chaetomiumconvolutum、Fusariumoxysporum、Tulasnellasp.;其中优势属为镰刀菌属(Fusarium)及木霉属(Trichoderma),其占比达30％以上。将获得的真菌进行回接，菌株E(Penicilliumoxalicum)、T1-1(Fusarium)、YY-1(Fusariumsolani)、YG-4(Fusariumoxysporum)、YG-5(Tulasnella)可以形成胞内菌丝团结构。其中菌株YG-5对石斛的生长起到了促进作用。离体条件下，菌株YG-5可分泌果胶酶以及纤维素酶，不分泌漆酶以及木聚糖酶，并且对有机磷和无机磷没有分解能力。 (2)将兰科菌根真菌YG-5接种于铁皮石斛无菌组培苗中，分析兰科菌根真菌对植物的影响。接种菌根真菌YG-5提高了铁皮石斛干重、鲜重、株高、叶片数、茎粗度、叶绿素含量，提高了组织中黄酮、游离氨基酸、可溶性糖、可溶性蛋白及丙二醛的含量;此外，也提高了酸性磷酸酶、谷氨酰胺合成酶活性。与对照组相比，接种菌根真菌处理未能提高多糖、脯氨酸含量及过氧化物酶、多酚氧化酶、酸性磷酸酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸合成酶的活性。总体来看，接种菌根真菌促进了铁皮石斛的生长发育，并提高了组织中一些代谢物质的含量。 (3)转录组结果显示，接种菌根真菌后，上调表达基因为508个，下调表达基因为64个，差异基因主要以上调表达为主。GO富集分析结果显示差异表达基因与对刺激的反应(responsetostimulus)、几丁质反应(responsetochitin)、黄酮化合物代谢(flavonoidmetabolicprocess)、对有机氮化合物的反应(responsetoorganonitrogencompound)、酸性磷酸酶活性(acidphosphataseactivity)、转录调节活性(transcriptionregulatoractivity)、DNA结合转录因子的活性(DNA-bindingtranscriptionfactoractivity)以及钙离子结合(calciumionbinding)等相关。KEGG富集分析显示，富集程度最高的是亚油酸代谢(linoleicacidmetabolism);富集数量最多的为转录因子(transcriptionfactors),其次为植物与病原体的相互作用(Plant-pathogeninteraction)、MAPK信号传导途径(MAPKsignalingpathway-plant)。 结合植物转录组测序结果及生物学指标测定，推断接种菌根真菌YG-5提高了植物的光传导能力，增强植物的光合作用;促进黄酮等物质的累积，提高了石斛的药用价值;增强植物对N、P元素的利用;接种菌根真菌增强钙离子结合基因的表达并促进细胞的信号转导，参与植物的碳氮代谢、细胞骨架的生成以及防御应答机制;菌根真菌参与MAPK信号传导途径，激活植物的抗逆基因表达，增强植物抗逆能力;菌根真菌侵入后，与植物发生了复杂的相互作用，使大量转录因子与RNA聚合酶结合，促进一些基因的转录，从而形成复杂的植物-菌根真菌基因互作网络。
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