摘要
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)简称金葡菌，是一种抗生素耐药谱不断扩大的医院和社区获得性感染病原体。金葡菌富丝氨酸血小板表面结合蛋白(serine-richadhesinforplatelets,SraP)配体结合区的L-lectin模块可以介导金葡菌对宿主细胞的粘附。巨噬细胞对于控制金葡菌感染具有双重作用，不仅在宿主的抗感染免疫中发挥重要作用，还会导致金葡菌在宿主体内的增殖和播散。既往研究发现，抗SraPL-lectin抗体能降低鼠巨噬细胞培养上清中的金葡菌数量，增加巨噬细胞吞噬金葡菌的数量，提示L-lectin可能介导金葡菌逃逸巨噬细胞的吞噬杀菌作用。因此我们设计并开展了本课题的研究以探讨L-lectin在金葡菌逃逸宿主免疫反应中的作用和机制，为减少金葡菌持续性感染和传播提供理论依据。 目的 1.利用金葡菌L-lectin敲除株和过表达株感染THP-1巨噬细胞，探究L-lectin对巨噬细胞免疫反应的影响。 2.通过转录组学测序和实时荧光定量PCR研究L-lectin影响巨噬细胞免疫反应的机制。 方法 1.利用同源重组技术构建L-lectin基因缺失株USA300ΔL-lectin;利用过表达质粒pRMC2构建L-lectin过表达株USA300pRMCL-lectin。 2.采用AnnexinⅤ-FITC和PI双染以及流式细胞术检测野生株、L-lectin敲除株、L-lectin过表达株分别感染巨噬细胞后细胞的凋亡情况;通过qRT-PCR检测M1、M2型极化相关细胞因子的表达水平以及形态学观察来判断巨噬细胞的极化类型，并通过qRT-PCR检测极化相关通路中关键转录调控因子的表达水平以筛选影响巨噬细胞极化的靶通路;通过吞噬实验和细胞内生存实验检测巨噬细胞对野生株、L-lectin敲除株、L-lectin过表达株的吞噬杀伤作用。 3.利用RNA-Seq技术对L-lectin缺失株和野生株进行转录组学测序，筛选出差异表达基因并对其进行GO注释和KEGG通路富集分析，qRT-PCR验证与巨噬细胞免疫反应相关的差异表达基因并探究L-lectin缺失影响巨噬细胞免疫反应的机制。 结果 1.AnnexinⅤ-FITC/PI法检测细胞凋亡发现，ΔL-lectin感染组细胞的早期凋亡率低于野生株感染组（P＜0.01）,L-lectin过表达菌株感染组细胞的早期凋亡率显著高于空载组（P＜0.0001）。ΔL-lectin感染组的晚期凋亡率略低于野生株感染组，L-lectin过表达组的晚期凋亡率略高于空载组，但差异无统计学意义。qRT-PCR的结果发现，ΔL-lectin感染组的促凋亡因子bax、fas的表达量低于野生株感染组（P＜0.0001;P＜0.01）,抑凋亡因子bcl2的表达量高于野生株感染组（P＜0.05）。L-lectin过表达株感染组的促凋亡因子bax、fas的表达量高于空载组（P＜0.05;P＜0.05）,抑凋亡因子的表达量低于空载组（P＜0.001）。 2.金葡菌敲除L-lectin后，M1型极化细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平显著降低（P＜0.01;P＜0.01;P＜0.01）,M2型极化细胞因子Arg1、IL-10、Tgf-β的表达水平显著升高（P＜0.05;P＜0.01;P＜0.05）,L-lectin敲除株感染后的巨噬细胞呈现出更加延伸、伸展的纺锤形形态;通过qRT-PCR检测极化相关通路中关键转录调控因子的表达，结果显示，L-lectin敲除可能通过降低AP-1和NF-κB的表达来减少单核细胞向M1型巨噬细胞极化（P＜0.01;P＜0.01）。 3.L-lectin敲除后，被巨噬细胞吞噬的金葡菌数量增加（P＜0.01）,金葡菌的细胞内生存率降低（P＜0.001）。过表达L-lectin后，被巨噬细胞吞噬的金葡菌数量略微减少，金葡菌的细胞内生存率略微升高，但差异无统计学意义。 4.转录组学测序及分析结果显示，与野生株相比，L-lectin缺失株有144个基因表达发生显著变化，其中显著上调和下调的基因分别有54个和90个。L-lectin基因缺失株中，脂蛋白、肽聚糖合成相关蛋白femAB、细胞壁表面锚定蛋白sasD、细胞外基质蛋白结合蛋白emp、α溶血素hly的表达水平显著下调，影响巨噬细胞对金葡菌的识别;一些发挥逃避调理吞噬作用的基因如葡萄球菌结合IgG蛋白sbi、纤连蛋白efb、金属蛋白酶aur、荚膜多糖合成酶capC的表达水平显著下调，促进巨噬细胞对金葡菌的吞噬作用;铁调节表面因子isdC、isdG1、亚铁转运蛋白feoB、α溶血素hly、金属蛋白酶aur的表达水平显著下调,降低金葡菌的细胞内生存能力，促进巨噬细胞对金葡菌的清除。 结论 L-lectin敲除可显著降低金葡菌相关毒力因子的表达、降低金葡菌的感染毒性，减少金葡菌引起的THP-1巨噬细胞的凋亡，减少具有促炎效应的M1型巨噬细胞极化，降低炎症反应。L-lectin敲除通过下调吞噬逃逸相关的基因，促进巨噬细胞对金葡菌的吞噬和清除。本研究表明，金葡菌SraPL-lectin可作为干预金葡菌免疫逃逸的重要靶点。
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