摘要
目的：研究胰腺癌细胞来源的外泌体miR-210-3p对胰腺癌血管生成的影响及机制。 方法：基于GEO数据库GSE43796分析6个胰腺癌组织和5个正常胰腺微阵列芯片中miRNA表达，筛选出差异表达的miR-210。在此基础上通过TCGA数据库分析、qRT-PCR检测胰腺癌组织与细胞系miRNA-210亚型miR-210-3p、miR-210-5p表达，筛选出差异表达亚型miR-210-3p。进一步收集22对胰腺癌患者癌与癌旁组织样本运用qRT-PCR验证miR-210-3p的表达。同时在TCGA数据库分析miR-210-3p表达与胰腺癌患者预后及与胰腺癌血管生成相关分子的相关性。超速离心法提取胰腺癌细胞外泌体，通过电镜拍摄、NTA分析、WB（CD63、TSG101、GRP94）进行鉴定。脐静脉内皮细胞（HUVECs）与高表达miR-210-3p的胰腺癌细胞外泌体共培后通过CCK-8、基质胶小管形成、细胞迁移实验（Transwell小室）检测外泌体对HUVECs血管生成能力的影响，并运用qRT-PCR检测血管生成相关分子（MMP9、VEGFA、FGF2、ANG、ANGPTL4、PDGFB）表达及WB检测VEGFA表达。接着，通过qRT-PCR检测胰腺癌细胞及其外泌体、18个正常人和20个胰腺癌患者血清外泌体miR-210-3p表达。并将胰腺癌细胞外泌体与HUVECs共培养或同时加入外泌体释放抑制剂（GW4869），检测miR-210-3p表达。HUVECs转染miR-210-3pmimic和miR-210-3pinhibitor后通过CCK-8、基质胶小管形成、细胞迁移实验（Transwell小室）检测外泌体对HUVECs血管生成能力的影响，并通过qRT-PCR检测血管生成相关分子表达及WB检测VEGFA表达。最后，将胰腺癌细胞外泌体与脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养，同时抑制miR-210-3p，检测HUVECs血管生成能力及血管生成相关分子的表达。 结果：GSE43796数据集显示miR-210在胰腺癌组织中高表达；相较于无显著差异表达的变体miR-210-5p，TCGA数据库分析及胰腺癌细胞系检测得出其亚型miR-210-3p在胰腺癌中高表达，并在胰腺癌细胞系及22对临床样本胰腺癌癌与癌旁组织中得到验证。TCGA数据库分析显示miR-210-3p表达与血管生成相关分子（VEGFA、ANG、ANGPTL4）表达呈正相关，与胰腺癌患者生存时间呈负相关。接着，透射电子显微镜、NTA分析及CD63、TSG101高表达提示外泌体提取成功。HUVECs与高表达miR-210-3p胰腺癌细胞系的外泌体共培养后CCK-8、基质胶小管形成、Transwell迁移实验显示其血管生成能力增强，同时qRT-PCR及WB显示血管生成相关分子VEGFA、ANG、PDGFB、ANGPLT4、MMP9基因和VEGFA蛋白表达升高。通过qRT-PCR检测胰腺癌细胞系CFPAC-1、PANC-1及其外泌体得出miR-210-3p高表达，进一步在20个胰腺癌患者和18个正常人血清外泌体验证。CFPAC-1、PANC-1细胞外泌体与HUVECs共培养后miR-210-3p表达升高且可被外泌体释放抑制剂（GW4896）降低，表明高表达miR-210-3p胰腺癌细胞通过外泌体将miR-210-3p递送至HUVECs。HUVECs经miR-210-3pmimic或miR-210-3pinhibitor干预后CCK-8、基质胶小管形成、Transwell迁移实验显示miR-210-3p促进其血管生成，qRT-PCR及WB显示miR-210-3p提升血管生成相关分子VEGFA、ANG、PDGFB、ANGPLT4、MMP9基因和VEGFA蛋白表达；且miR-210-3pinhibitor减弱高表达miR-210-3p胰腺癌细胞系的外泌体对于HUVECs的促血管生成作用。 结论：miR-210-3p在胰腺癌组织及细胞系中表达升高，且与血管形成呈正相关及与患者生存时间呈负相关；胰腺癌外泌体高表达miR-210-3p并将其传递至脐静脉内皮细胞，进而促进脐静脉内皮细胞的小管形成、迁移与增殖能力，促进肿瘤进展。因此本研究可能为肿瘤抗血管治疗提供了一种潜在靶点。
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