摘要
研究背景和目的： 放射性肺纤维化（radiation-inducedpulmonaryfibrosis,RIPF）是胸部肿瘤放疗与核辐射事故损伤的常见并发症，其在放疗后的平均发生率为16%~28%。RIPF是由早期间质性肺炎逐渐发展为晚期肺纤维化的过程，主要临床表现为呼吸困难加重、肺功能恶化，最终导致呼吸衰竭死亡，对人类健康构成极大的威胁。然而，目前RIPF的发病机制仍不明确，在临床治疗方面，尼达尼布、吡非尼酮的治疗效果有限，因此急需阐明RIPF的发病机制，为防治RIPF奠定基础。 有研究证实，肺泡上皮细胞（alveolarepithelialcells,AEC）发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）是参与形成RIPF病灶的成纤维细胞主要来源之一，AEC的损伤以及发生EMT在肺纤维化（pulmonaryfibrosis,PF）的发病机制中发挥关键作用。EMT受到多种因素的影响。最新研究表明，血小板反应蛋白-1（thrombospondin,TSP-1）参与了PF和EMT的发展过程。TSP-1是一种细胞外基质糖蛋白，在细胞粘附、迁移、增殖、衰老、凋亡、血管生成、氧化应激、炎症和免疫调节中发挥多种生物学作用。已有研究表明TSP-1参与转化生长因子-β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）诱导的EMT和博莱霉素诱导的PF，然而，其在放射诱导的EMT和PF中的作用尚未有相关报道。因此，探索放射后TSP-1与EMT发生的相关性，将为明确RIPF发病机制提供重要的实验依据。本研究以AEC和小鼠为研究对象评价TSP-1在RIPF中的作用，并探索其调控EMT的机制，为RIPF防治提供新的靶点。 方法： 1.评价TSP-1在RIPF中的表达变化 （1）体内实验：以C57BL/6小鼠为研究对象，分为对照组（Control）和照射组（IR），用60Coγ射线全肺16Gy照射小鼠肺部建立RIPF模型，分别在建模后第12周和第24周开展相关实验。micro-CT和肺系数评价小鼠肺损伤和肺实变情况，Hamp;E染色观察肺组织的形态变化，Masson染色观察肺组织胶原沉积水平；免疫组化，Westernblot和qRT-PCR检测肺组织TSP-1的蛋白和mRNA表达水平。 2.阐明抑制TSP-1对放射诱导的EMT和PF的影响 （1）体内实验：以C57BL/6小鼠和TSP-1全身敲除鼠为研究对象，分为野生辐照组（IR）和TSP-1敲除辐照组（IR+TSP-1-/-），60Coγ射线全肺16Gy照射建立PF模型，分别在建模后第12周、第16周和第24周开展相关实验。micro-CT和肺系数评价小鼠肺损伤和肺实变程度，Hamp;E染色观察肺组织形态变化，Masson和天狼猩红染色检测肺组织胶原沉积水平，FlexiVent功能仪评估小鼠肺功能水平。 （2）体外实验：以RLE-6TN为研究对象，分组为阴性对照组（siTSP-1NC）、TSP-1转染组（siTSP-1）、阴性对照辐照组（siTSP-1NC+IR）和TSP-1转染辐照组（siTSP-1+IR），Westernblot检测各组细胞中TSP-1、E-cadherin、α-SMA和N-cadherin的蛋白表达，光学显微镜下观察细胞形态学变化。 3.探索TSP-1介导细胞衰老在放射诱导的EMT中的机制 3.1抑制TSP-1对细胞衰老和氧化应激的影响 （1）体内实验：以C57BL/6小鼠和TSP-1基因敲除鼠为研究对象，β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色检测肺组织衰老水平，免疫荧光检测肺组织衰老指标p21和p16的蛋白表达，ELISA检测肺组织氧化应激指标SOD、MDA和GSH的蛋白表达。 （2）体外实验：以RLE-6TN为研究对象，分为对照组（Con），转染组（siTSP-1）辐照组（IR）和TSP-1转染辐照组（IR+siTSP-1），流式细胞术检细胞ROS水平，SA-β-Gal染色检测细胞衰老水平。 3.2探讨氧化应激、衰老和EMT之间的相互关系 （1）探讨氧化应激和衰老之间的关系 以RLE-6TN为研究对象，分为对照组（Con）、N-乙酰半胱氨酸组（NAC）、辐照组（IR）和辐照+N-乙酰半胱氨酸组（IR+NAC），流式细胞术检测各组细胞ROS变化，SA-β-Gal染色检测各组细胞衰老水平。 （2）评价衰老对放射诱导的EMT的影响 ①以RLE-6TN为研究对象，不同浓度D-半乳糖（D-Gal）诱导细胞衰老，CCK-8细胞增殖法和SA-β-Gal染色检测细胞活力和细胞衰老水平，选择最佳浓度构建细胞衰老模型。 ②以RLE-6TN为研究对象，分为对照组（Con）、D-半乳糖（D-Gal）、辐照组（IR）和辐照+D-半乳糖组（IR+D-Gal），Westernblot检测p21、p16、E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达。 结果： 1．TSP-1在RIPF中高表达 Micro-CT和肺系数结果显示，IR组肺损伤程度和肺系数高于Control组；Hamp;E和Masson染色结果显示，与Control组相比，IR组肺泡结构损伤严重，肺组织胶原沉积增多；免疫组化、Westernblot和qRT-PCR结果显示IR组肺组织TSP-1蛋白和mRNA表达高于Control组。 2．抑制TSP-1减轻放射诱导的PF和EMT （1）micro-CT和肺系数结果表明，与IR组相比，IR+TSP-1-/-组小鼠肺损伤程度减轻，肺系数下降；Hamp;E染色结果显示，IR+TSP-1-/-组肺组织破坏程度减轻，Masson和天狼猩红染色结果显示IR+TSP-1-/-组肺组织胶原沉积减少，FlexiVent肺功能仪结果显示，IR+TSP-1-/-组小鼠肺功能与IR组相比有所改善。 （2）Westernblot结果显示，与siTSP-1NC+IR组相比，siTSP-1+IR组上皮标志物E-cadherin蛋白表达上升，间质细胞标志物α-SMA和N-cadherin蛋白表达下降；光镜下观察到siTSP-1+IR组间质细胞数量较siTSP-1NC+IR组减少。 3.TSP-1介导细胞衰老促进放射诱导的EMT 3.1抑制TSP-1减轻肺组织衰老和氧化应激水平 （1）SA-β-Gal染色结果显示，与Control组相比，IR组小鼠肺组织衰老加速，而IR+TSP-1-/-组小鼠肺组织衰老水平较IR组减轻；ELISA结果显示，IR组SOD和GSH降低，MAD升高，与IR组相比，IR+TSP-1-/-组肺组织衰老减轻，SOD和GSH升高，MAD降低。 （2）流式细胞术和SA-β-Gal染色结果显示，与Con组相比，IR组ROS升高，细胞衰老加速；抑制TSP-1表达后能减轻放射后的ROS和细胞衰老水平。 3.2氧化应激介导细胞衰老 流式细胞术和SA-β-Gal染色结果显示，IR组ROS和细胞衰老较Con组明显增加；与IR组相比，IR+NAC组ROS和细胞衰老水平减轻。 3.3加速衰老促进放射诱导的EMT CCK-8细胞增殖法和SA-β-Gal染色结果显示，D-Gal浓度为20mg/mL是构建细胞衰老模型的最佳浓度。Westernblot结果显示，与IR组相比，IR+D-Gal组p21和p16蛋白表达增加，E-cadherin表达降低，N-cadherin表达增高；光镜下观察到IR+D-Gal组间质细胞数量多于IR组。 结论： 1.60Coγ射线16Gy成功构建RIPF动物模型，首次明确了TSP-1参与RIPF，并且在RIPF中高表达。 2.TSP-1通过调控EMT参与RIPF的发展，抑制TSP-1能有效减轻RIPF。 3.首次揭示了TSP-1通过氧化应激介导细胞衰老调控放射诱导的EMT参与RIPF的发病机制。
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