摘要
【目的】 基于生物信息学的数据分析，研究COL4A4基因在皮肤黑色素瘤(Skincutaneousmelanoma,SKCM)与正常皮肤组织中的表达水平的差异，通过免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)和实时荧光定量PCR法（QuantitativeReal-timePCR,QRt-PCR）验证COL4A4基因在SKCM组织和正常皮肤组织的蛋白和mRNA表达的差异性。在此基础上构建COL4A4基因在皮肤黑色素瘤中的预后模型并加以验证，以期对皮肤黑色素瘤的早期筛查及预后评估提供帮助。 【方法】 1.通过癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas,TCGA）(https://portal.gdc.cancer.gov/)数据库与基因型和基因表达量关联数据库(Genotype-TissueExpression,GTEx)（https://commonfund.nih.gov/gtex）去收集COL4A4基因转录组数据并使用Toil流程分析了COL4A4基因的表达与33种常见肿瘤的相关性，发现COL4A4基因在黑色素瘤组中存在明显的表达差异。2.收集广东医科大学附属医院病理科20例皮肤黑色素瘤组织和癌旁组织标本，通过免疫组化检测验证了SKCM组织和正常皮肤组织的COL4A4蛋白表达水平的差异性，再从中选取10例手术切除的SKCM组织和癌旁组织，再通过QRt-PCR法检测验证SKCM组织和正常皮肤组织的COL4A4mRNA表达水平差异。3.通过秩和检验方法对从数据库中所收集到的SKCM样本中的COL4A4基因的表达数据进行分析，并使用R统计软件（3.6.3版本）进行受试者工作特征曲线（Receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC）证明了COL4A4存在诊断价值。然后使用DESeq2软件完成对COL4A4的共表达差异基因的筛选。通过基因本体（GeneOntology,GO）数据库、基因组百科全书（KEGG）数据库、基因集富集分析（GeneSetEnrichmentAnalysis,GSEA)数据库、蛋白质互作网络（STRING）数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)、综合分析癌症基因和临床资料（cBioCancerGenomicsPortal,cBioportal）数据库(https://www.cbioportal.org/)、人类蛋白图库（HumanProteinAtlas,HPA）数据库(https://www.proteinatlas.org/）等对COL4A4基因的富集通路和生物功能进行探索，并通过单样本基因集富集分析对该基因的表达与免疫细胞浸润的相关性和程度进行了量化。4.采用Kaplan-Meier法对SKCM患者进行生存分析，然后通过数据库中所收集到的SKCM患者的临床相关数据完成了对COL4A4基因与SKCM病理和临床特征的相关性分析。最后搭建一个黑色素瘤患者COL4A4基因评分模型，应用多因素回归方法，即通过单因素和多因素Cox分析鉴定模型的预后价值并建立预后列线图模型，直观预测SKCM患者中COL4A4表达对其生存情况的影响。 【结果】 1.对所获取的RNA-seq数据（TPM格式）进行分析，发现COL4A4基因的表达情况在泛癌中的肿瘤样本和正常样本之间存在差异，而且在黑色素瘤组中表达差异更为显著。2.IHC和QRt-PCR实验结果提示，COL4A4基因在皮肤黑色素瘤细胞中的蛋白表达水平和mRNA表达水平均降低。3.通过秩和检验分析再次在大数据中证实了COL4A4基因在SKCM组织和正常组织中的表达具有显著差异（P＜0.001）。COL4A4基因预后风险模型ROC曲线的AUC值为0.652，表明该模型存在一定的诊断价值。功能富集分析提示COL4A4基因低表达可能与JAK-STAT信号通路、IL3信号、G蛋白偶联受体（GPCRs）信号通路、白介素参与通路等有关联。MethSurv数据库中发现SKCM患者的COL4A4DNA序列中的大多数甲基化位点都是低甲基化的，而且在患者的总体生存率方面，COL4A4DNA序列中的低甲基位点占比越大，生存率越低；在cBioPortal数据库发现COL4A4在SKCM中的突变率为4%。通过ssGSEA行COL4A4免疫浸润分析提示COL4A4基因的表达高低与T细胞、B细胞、CD8+T细胞、NK细胞、aDC细胞、Cytotoxic细胞等免疫细胞的浸润程度均为正相关性。4.K-M生存曲线中提示COL4A4低表达预后较差（P=0.001）。在多因素COX回归中，提示COL4A4在SKCM中可作为独立预后风险因子（HR=0.550,95%CI=（0.295~1.024）,P=0.059）。列线图模型提示低表达的COL4A4伴有较高的单项分数，而结合其它单项分数获得的总分数越高，对应患者的生存率越低，所以可较为直观的对皮肤黑色素瘤患者的生存进行预测。因此该预测模型对SKCM患者的生存预测有较大的潜力。 【结论】 COL4A4基因在正常皮肤组织与皮肤黑色素瘤组织中存在明显的表达差异，而且皮肤黑色素瘤患者的肿瘤病理特征、体内的免疫细胞浸润程度和不良预后均与COL4A4基因的低表达相关，考虑该基因可能是通过调节机体的免疫反应和调节JAK-STAT信号通路、G蛋白偶联受体信号通路和白介素参与的信号通路等去影响皮肤黑色素瘤的发生、转移，进而影响SKCM的预后。所构建的SKCM的COL4A4基因预后模型具有一定的诊断价值，未来可期待用于SKCM的发病预测、治疗方案的制定、疗效的评估和肿瘤复发的监测，而且对于治疗黑色素瘤的靶向治疗药物的研发也有一定的启发。
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