摘要
金铁锁（Psammosilenetunicoides）是中国西南部的石竹科金铁锁属珍稀濒危药用植物，其主要化学成分为三萜皂苷类化合物。利用毛状根规模化培养技术能有效解决野生金铁锁市场的资源稀缺问题。本研究以外源褪黑素作为诱导子来提高金铁锁毛状根三萜皂苷的产量，筛选褪黑素诱导皂苷合成及主根生长的最佳处理条件，检测诱导后第二信使动态变化、抗氧化酶活性和内源植物激素含量变化，并结合转录组测序技术分析褪黑素诱导皂苷合成和主根生长的调控机制。主要研究结果如下: （1）总皂苷水平与褪黑素浓度之间存在负相关，10mg/L褪黑素诱导最有助于金铁锁毛状根总皂苷的积累。用10mg/L褪黑素处理的毛状根在1、2、6和10天积累的总皂苷含量最高，与对照组相比，分别增加了15.9％、84.7％、52.7％和43.0％。此外，补充褪黑素后，金铁锁毛状根液体培养基中的皂苷含量也得到了提高，10、50和100mg/L褪黑素处理2天后的皂苷含量分别增加了34.4％、31.3％和50.0％。同时，褪黑素诱导还提高了皂皮酸、丝石竹皂苷元和丝石竹皂苷元3-O-β-D葡萄糖醛酸甲酯的含量，最高分别是对照组的2.99倍、2.26倍和2.36倍。 （2）褪黑素诱导可显著促进金铁锁毛状根生物量的积累，增加主根长度、直径、表面积和体积，提升毛状根品质。所有褪黑素浓度（10、50和100mg/L）处理2、6和10天后，明显增加了毛状根的干重（10天时100mg/L除外）。褪黑素诱导2天后，主根的直径和长度、表面积、体积和干重与对照组相比，最大提升分别为60.0％、17.4％、23.0％、25.9％和17.6％。通过解剖及显微观察，发现褪黑素诱导的主根表皮细胞数量和大小明显优于对照，最高相比对照组分别提升31.0％、141.1％。在所有褪黑素浓度处理2天后，毛状根的主根横截面积都比1天时的大，100mg/L褪黑素处理2天的主根横截面积最大（CK的2.43倍）。总之,10mg/L褪黑素诱导2天的毛状根总皂苷产量增幅最大（117.0％）,同时显著提升了毛状根的品质。 （3）外源褪黑素激活了ROS的爆发，增加了NO和Ca2+含量，增强抗氧化酶（SOD、CAT、GR和POD）活性。褪黑素的诱导调节了金铁锁毛状根中与植物次级代谢和根系生长相关的植物激素含量。10和50mg/L的褪黑素处理显著增加水杨酸-2-O-β-葡萄糖苷（SAG）的含量，分别达到对照的3.45倍和2.96倍。50mg/L褪黑素提升了游离JA、OPDA（JA前体）和JA-Phe（JA共轭物）的含量。褪黑素对ABA和ACC（ET类型）的生物合成最大促进作用分别为36.9％和15.0％。所有褪黑素处理组在2天内的游离IAA和吲哚-3-乙酸甲酯(MEIAA)水平较低，但近乎所有IAA共轭类型和其他3种类型生长素在10和50mg/L褪黑素处理后都有所增加。在所有褪黑素浓度处理的毛状根中发现4种细胞分裂素代谢物含量增加，而其他4种细胞分裂素代谢物含量减少。 (4)基于RNA-Seq分析，转录调节主要发生在褪黑素诱导的早期阶段，褪黑素主要在低浓度水平上触发皂苷生物合成相关的转录本。发现DXS(28284/f10p0/1661）、SE(29164/f14p0/1613)、COBL7(18345/f3p0/2496)和Egase(7000/f3p0/3602)与4个WRKYs(WRKY33、WRKY41和2个WRKY40s)、1个NAC(ATAF2)和2个ERFs(DREB2A和RAP2-3)表现出显著的表达量相关性，推断褪黑素可能诱导金铁锁毛状根中“WRKY/NAC/ERF-DXS/SE-皂苷生物合成”和“WRKY/NAC/ERF-COBL7/Egase-主根生长”的调节途径。 总体上，本研究为后续利用基因工程手段提高金铁锁毛状根皂苷产量和主根品质提供了依据，有利于降低培养成本，为该技术的实际应用提供了理论基础。
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