摘要
研究背景 食管癌是全球第八大恶性肿瘤，也是中国第四大癌症死亡原因。食管鳞状细胞癌(Esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)是我国最常见的食管癌亚型,尽管随着手术治疗以及放化疗技术的发展，食管癌患者的生存得到改善，但由于食管鳞状细胞癌耐药性强、复发率和转移率高，患者预后仍较差，亟需寻找新的治疗手段。 嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor,CAR)T细胞疗法已成功应用于血液系统恶性肿瘤的治疗并取得了重大突破。然而最新临床研究表明，约50％的淋巴细胞白血病患者可因抗原丢失导致复发。由于实体瘤缺乏特异性抗原且具有较强的免疫抑制微环境，使得CAR-T细胞在实体瘤治疗中被严重限制。因此,进一步探索CAR-T治疗耐受的分子机制，对于CAR-T细胞至关重要。CD276是B7/CD28超家族的成员之一，是一种Ⅰ型跨膜蛋白，研究表明CD276在多种恶性肿瘤中高表达，而在正常组织中低表达或不表达，是具有前景的免疫治疗靶点。本课题组前期研究证实CD276在ESCC组织中表达显著升高，靶向CD276的CAR-T细胞可以用于ESCC的治疗。此外，课题组发现CAR-T细胞多次治疗后部分肿瘤细胞可发生耐受。 本课题旨在进一步鉴定影响CAR-T细胞抗肿瘤活性的关键基因，并探索该基因的功能及潜在分子机制。 目的 筛选CAR-T耐受细胞系中的关键基因并验证其作用，探索候选基因对CAR-T细胞抗肿瘤活性的影响及分子机制。 方法 (1)CAR-T慢病毒载体的构建与CAR-T细胞的制备 通过酶切电泳对构建好的CD276CAR慢病毒质粒进行鉴定，利用第三代慢病毒包装系统制备慢病毒;通过Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离PBMC,并使用磁珠法分选人外周血T细胞;慢病毒离心法感染人T细胞制备CD276CAR-T细胞。 (2)潜在候选基因的筛选 通过RNA测序技术分析CAR-T耐受细胞基因表达谱，生物信息学分析鉴定差异表达基因;利用GEPIA数据库分析关键基因(CTSL)在肿瘤组织和癌旁组织中的表达差异。 (3)CTSL基因对食管鳞癌细胞的功能验证 构建CTSL过表达细胞系，克隆形成实验和CCK-8细胞增殖实验分析CTSL过表达对食管鳞癌细胞增殖的影响;划痕实验检测CTSL过表达对食管鳞癌细胞迁移的影响。 (4)CTSL基因对CAR-T细胞杀伤功能的影响 构建表达荧光素酶的CTSL过表达细胞系，体外共培养杀伤实验验证CTSL过表达对CAR-T细胞抗肿瘤活性的影响。 (5)CTSL基因对CAR分子的切割功能验证 使用Western-Blot实验分析CAR分子在肿瘤细胞和293T细胞中的切割断裂及CTSL过表达对CAR分子切割功能的影响。 结果 (1)CAR-T慢病毒载体的构建与CAR-T细胞的制备 成功构建CD276CAR慢病毒质粒，并制备出约3.2×107TU/ml的高滴度慢病毒;分选前后CD3+T细胞的阳性率分别在60％和99％左右，证明成功分选出T细胞;CD276CAR-T细胞阳性率在80％以上，成功制备出CD276CAR-T细胞，可以通过流式细胞术验证。 (2)潜在候选基因的筛选 通过生物信息学分析，CTSL基因在CAR-T细胞耐受细胞系中高表达，且在多种肿瘤组织如DLBC、GBM、PAAD、SKCM、THYM等中的表达明显高于癌旁组织。 (3)CTSL基因对食管鳞癌细胞的功能验证 成功构建出CTSL过表达稳转细胞系，可以通过Western-Blot验证;CTSL过表达抑制食管鳞癌细胞的增殖和迁移，可以通过克隆形成实验、CCK-8实验和划痕愈合实验进行验证。 (4)CTSL过表达对CAR-T细胞杀伤功能的影响 成功构建CTSL过表达的荧光素酶稳转细胞系，可以通过流式细胞术、荧光素酶实验和Western-Blot验证;体外杀伤实验证明，在K70细胞系中，CTSL过表达抑制CAR-T细胞的杀伤活性，在K150细胞中，高效靶比时抑制功能不明显。 (5)CTSL基因对CAR分子的切割功能验证 CAR分子在肿瘤细胞、T细胞和293T细胞中均能够被切割，且CTSL过表达能够促进CAR分子的切割断裂，可以通过Western-Blot进行验证。 结论 (1)CTSL基因在CAR-T耐受细胞系中高表达，且在多种肿瘤组织中高表达。 (2)CTSL过表达抑制食管鳞癌细胞的增殖与迁移。 (3)CTSL过表达能够抑制CAR-T细胞的杀伤功能。 (4)CTSL基因介导CAR分子的切割断裂。
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