摘要
近年来，噬菌体展示技术因其高通量，高效率及低成本的筛选特点成为药物开发的重要手段，在抗体药物和肽类药物开发、疫苗研制，蛋白类药物改造中广泛应用。本论文利用噬菌体展示技术筛选靶蛋白的亲和肽配体分子，为药物早期开发先导分子的筛选提供新思路。 在药物开发过程中，分子探针在药物靶点识别方面具有非常重要的作用。以抗肿瘤药物靶点二氢叶酸还原酶(DHFR)为模型蛋白进行配体筛选用于肽探针开发。利用基因工程技术表达与纯化DHFR,通过噬菌体七肽展示文库的四轮淘洗,筛选得到与DHFR特异结合的共有氨基酸序列。随后以固相合成相关多肽，并进行N端和C端化学荧光基团的修饰，用生物物理方法验证它们相互结合的亲和力，得到具有0.56μM亲和力的肽探针，为快速筛选靶蛋白的探针提供新思路。 环肽因结构构象限制、结构刚性等特点，具有更高的稳定性，靶向选择性,更具有成为药物的潜力。因此，构建噬菌体展示的随机环肽库，在环肽药物的开发中具有重要意义。在肽链中引入具有邻位反应活性的非天然氨基酸，与半胱氨酸形成不可还原的硫醚键结构进而成环。以终止密码子抑制法引入非天然氨基酸O2beY,即琥珀终止子编码非天然氨基酸,且该终止子借助与其正交的氨酰tRNA合成酶-tRNA正交对PEVOL-Mn-XYRS,将非天然氨基酸引入肽链中。构建肽库的方法是全质粒-PCR产物自连接,即将七肽随机序列扩增至载体Pcomb3xss噬菌粒上，限制性内切酶消化扩增产物,T4连接酶进行连接并转导至大肠杆菌TOP10等过程构建噬菌粒库。成功构建的噬菌粒库在辅助噬菌体M13K07,PEVOL-Mn-XYRS及非天然氨基酸O2beY存在的培养基中表达并展示在噬菌体上，可以制备为用于筛选的噬菌体感染库。在经过测序分析之后得到正确率为96％,库容量为1.6×109，随机序列无偏向性的七肽随机展示文库。 在完成噬菌体展示环肽库基础上，利用噬菌体展示技术筛选RNF56、RNF55、PTP-1B、TNFα四个靶蛋白的环肽配体分子。RNF56、RNF55具有介导PTKs的泛素化降解的功能;PTP-1B是一种非跨膜蛋白酪氨酸磷酸水解酶，是胰岛素信号转导通路中的关键的负调节蛋白;TNFα是一种具有广泛生物学功能的多效细胞因子，与多种疾病相关。首先，通过基因工程技术表达并纯化蛋白RNF56、RNF55、PTP-1B及TNFα。进一步以所构建的环肽库，在M13K07,PEVOL-Mn-XYRS及O2beY参与下，经过四轮淘洗，分别获得具有收敛的含非天然氨基酸的共有氨基酸序列，其结果如下:与RNF56特异结合的五种类型的共有氨基酸序列CQGERGYMY*、CQKKKKPSY*、CIAEHKILY*、CY*PTDHPGY*、CGESREARY*;RNF55特异结合的四种类型的共有氨基酸序列CLGTTRRMY*、CPRSLLDAY*、CLISLRLKY*、CSPNTWGWY*;PTP-1B特异结合的十种类型的共有氨基酸序列如CVGVLSRTY*、CPPLSRLFY*、CSSSYAGDY*、CSTLRYMKY*等;TNFα特异结合的十种类型的共有氨基酸序列如CVQRKNEMY*、CVGEGTPPY*、CPRSLLDAY*、CRGSKWTTY*等。为四个靶蛋白筛选环肽药物的先导分子奠定基础。 本文通过噬菌体展示技术的研究，筛选得到与DHFR结合的肽探针分子，为构建药物筛选探针提供思路。其次，构建噬菌体展示的非天然氨基酸环肽库,以此为基础，筛选了四个靶蛋白的环肽序列。成功建立了噬菌体环肽库展示技术,为环肽药物筛选奠定了一定基础。
NETL