摘要
研究目的: 近年来，有关中医药应用于包括恶性肿瘤在内的难治性疾病的探索，引起了越多越多学者们的关注。藤黄酸(GambogicAcid,GA)提取于中药藤黄，既往研究发现GA能通过够诱导细胞周期阻滞等机制，显著抑制肿瘤细胞的增殖，但因水溶性差且毒副反应大限制其临床应用。靶向药物递送系统的出现，不仅提高了药物的肿瘤靶向性，还提高了药物作用于肿瘤病灶局部的有效浓度。本实验拟合成并采用硅量子点(SiQuantumDots,SiQDs)作为荧光材料，以GA及EGFR蛋白短肽作为模板双分子，通过分子印迹技术(MolecularlyImprintingTechnology,MIT)制备兼具荧光效应及主动靶向性的负载GA的双模板分子印迹聚合物(MolecularlyImprintedNanoparticles,MIPs),以期该MIPs纳米载体作为具有良好抑瘤作用及生物安全性的靶向性药物递送系统(TargetedDrugDeliverySystems,TDDS),用以提高GA作用于肿瘤组织有效浓度的同时优化GA在体内的生物利用度。 研究方法: 通过微波辅助合成法制备具有荧光效应的SiQDs,并以此为荧光材料、以具有细胞毒性的GA单体及肿瘤细胞表面高表达的EGFR蛋白短肽作为模板双分子，结合MIT构建负载GA的双模板MIPs纳米载体。通过能量色散光谱(EnergyDispersiveX-RaySpectroscopy,EDS)、傅里叶变换红外(FourierTransformInfraredSpectroscopy,FT-IR)、动态光散射(DynamicLightScattering,DLS)、透射电镜(TransmissionElectronMicroscope,TEM)及扫描电镜(ScanningElectronMicroscope,SEM)等技术对MIPs纳米载体进行表征研究。通过高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)测定MIPs纳米载体的包封率(EncapsulationEfficiency,EE)、载药率(DrugLoading,DL)及药物缓释性能。通过共聚焦显微镜及荧光显微镜观察EGFR野生型人结肠癌细胞HT-29对MIPs纳米载体的摄取情况。通过CCK-8毒性实验、AnnexinⅤ/PI流式细胞术评价MIPs纳米载体在体外对HT-29细胞系的细胞毒性、抑制细胞增殖以及促进细胞凋亡作用。建立裸鼠HT-29细胞系皮下移植瘤模型，观察荷瘤裸鼠皮下移植瘤及体重的变化，评价MIPs纳米载体的体内抑瘤性，结合重要器官H&E染色，多维度评价MIPs纳米载体安全性;观察荷瘤裸鼠近红外活体成像结果，评价MIPs纳米载体的体内靶向性。 研究结果: 成功构建出SiQDs及负载GA的双模板分子印迹聚合物(GA-EGFR-MIPs)纳米载体，通过表征验证了MIPs纳米载体结构的完整性及稳定性。通过HPLC测定了MIPs纳米载体达到最佳EE及DL时的GA与空白MIPs纳米载体的质量配比为1∶4,且最佳EE及DL分别为87.76±0.7％和30.56±1.7％,其次验证了MIPs纳米载体缓释性能，且对比不同pH条件下结果侧面反映了MIPs纳米载体的pH响应机制。体外实验结果显示，MIPs纳米粒子可以被EGFR野生型的人结肠癌细胞HT-29顺利摄取，并通过诱导细胞凋亡抑制HT-29细胞体外增殖。体内实验结果显示，对比同等剂量的GA裸药组，MIPs纳米载体在HT-29细胞系构建的荷瘤裸鼠皮下瘤模型中显著抑制了肿瘤生长且安全性良好，近红外活体成像技术验证了该纳米载体具备体内较强的肿瘤靶向性。 结论: 合成过程中，通过载入SiQDs、EGFR蛋白短肽及GA单体，分别赋予了MIPs纳米载体荧光性、肿瘤靶向性及抑瘤性，通过MIT共价键结合方式使得MIPs纳米载体在弱酸性的肿瘤微环境下得以缓慢释放GA。由此，MIPs纳米载体不仅达到了可视化靶向肿瘤病灶局部的目的，而且具有了可控性缓慢释放药物的效果。该MIPs纳米载体的构建有效降低了GA的毒副作用，间接提高了GA发挥抑瘤作用的有效浓度，实现了GA体内生物利用度的最大化。综上，GA-EGFR-MIPs纳米载体通过提高GA体内的主动靶向性和生物利用度，在结直肠癌中发挥了显著的抗肿瘤效应并具有良好的安全性。本研究具有一定的临床应用前景，有望为结直肠癌抗肿瘤治疗提供一种新思路。
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