摘要
目的： 近年来，乳腺癌在恶性肿瘤中的发病率逐渐升高。根据2020年最新统计结果显示，乳腺癌在女性恶性肿瘤的发病率和死亡率均达到了第一。随着医学技术的进步，早期筛查，高分辨率成像技术以及有效的化学疗法，放射疗法，靶向疗法和免疫疗法的在乳腺癌防治中的应用，乳腺癌所有阶段的五年生存率已达到较高水平。但是，三阴性乳腺癌的预后效果仍然很差。 传统中医和现代研究表明，肿瘤的重要病因病理机制与血液微循环障碍和血液粘稠度增加等有关。所以从改善血液循环出发，活血化瘀类中草药例如丹参、莪术、三七、王不留行等等均可以发挥抗肿瘤作用。现代研究表明，丹参酮ⅡA是丹参中的一种天然二萜醌类化合物，具有多种药理作用，其中主要包括抗炎抗病毒，抗过敏，抗动脉粥样硬化，保护神经系统，防止心绞痛和心肌梗死等等。丹参酮ⅡA，作为活血化瘀中药丹参的有效成分之一，近年来在肿瘤防治方面的研究越来多，但是对三阴性乳腺癌作用的研究尚未报道。为了解丹参酮ⅡA对三阴性乳腺癌的作用机制，本研究通过采用网络药理学的方法预测丹参酮ⅡA治疗三阴性乳腺癌的分子靶点及相关信号通路，并通过体内和体外实验进行验证。 方法： 1.应用BATMAN-TCM和TCMSPDatabaseandAnalysisPlatform两个中药成分-靶点数据库，并根据每个数据库的不同标准来筛选丹参酮ⅡA的作用靶点。应用ComparativeToxicogenomicsDatabase和TherapeuticTargetDatabase两个数据库来筛选与三阴性乳腺癌有关的疾病靶点。通过Cytoscape软件构建分析丹参酮ⅡA和三阴性乳腺癌之间的成分-靶点作用网络，通过KEGG通路富集分析靶点所涉及到的主要信号通路。 2.通过CCK-8细胞毒活性试验、细胞平板克隆实验、划痕实验和Transwell实验等体内实验来验证丹参酮ⅡA对三阴性乳腺癌4T1细胞株的抑制作用。 3.使用4T1细胞建立皮下种植瘤小鼠模型，之后使用小鼠瘤体建立原位移植瘤小鼠模型。运用HE切片来检测原位荷瘤小鼠的肺组织内转移灶的产生时间，检测阿霉素和丹参酮ⅡA对三阴性乳腺癌荷瘤小鼠的抑制作用，以及对原位荷瘤小鼠肺转移的影响。 4.对预测的结果进行实验验证，使用Westernblot验证丹参酮ⅡA对三阴性乳腺癌4T1细胞系相关靶点蛋白的表达情况，同时探究阿霉素和丹参酮ⅡA对原位荷瘤小鼠肺转移的影响。 结果： 1.应用BATMAN-TCM和TCMSPDatabaseandAnalysisPlatform两个中药成分-靶点数据库，并根据每个数据库的不同标准来筛选得到丹参酮ⅡA作用靶点有123个。应用CTD和TTD两个疾病靶点数据库来筛选得到与三阴性乳腺癌有关的1344个疾病靶点。经过网络药理学对接后共得到19个共同靶点。 2.经KEGG通路富集分析后得出，这19个靶点主要涉及到癌症相关信号通路有12个，作用能力较强的有凋亡相关信号通路，NFκB信号通路，PI3K-Akt信号通路，MAPK信号通路，TNF信号通路和HIF-1信号通路（P＜0.001）。 3.丹参酮ⅡA对三阴性乳腺癌4T1细胞株48h的IC50浓度为50μM。并在一定范围内丹参酮ⅡA与4T1细胞呈现时间和剂量依赖性（P＜0.05）。使用不同浓度（12.5μM，25μM，50μM）的丹参酮ⅡA处理4T1细胞，24h后检测发现在25μM时丹参酮ⅡA可以有效抑制4T1细胞的迁移和侵袭，并且呈现时间和剂量依赖性（P＜0.05）。 4.阿霉素和丹参酮ⅡA对体内移植瘤也有一定程度的抑制作用。并且两者在原位移植瘤小鼠模型中，可以延长其肺转移出现的时间，对肺转移后也起到一定的抑制作用（P＜0.05）。 5.丹参酮ⅡA抗三阴性乳腺癌机制的初步探讨：通过Westernblotting实验发现，在4T1细胞培养过程经过丹参酮ⅡA处理后，细胞的BCL2，MMP9和NFKB1基因表达降低，TP53及其磷酸化蛋白的表达升高。检测原位移植瘤小鼠的肺组织相关靶蛋白水平后发现，其MMP9基因的表达在早期就存在统计学意义，并且随着时间的延长，表达量越低（P＜0.05）。但是在确定转移后MMP9的表达没有统计学差异。小鼠肺组织内NFKB1基因的表达在早期没有统计学差异，但是在晚期即荷瘤小鼠发生肺转移后，阿霉素组和丹参酮ⅡA组的NFKB1基因的表达比模型组要低（P＜0.05）。 结论： 中药单体丹参酮ⅡA不仅能在体外实验中抑制三阴性乳腺癌4T1细胞株的增殖，迁移和侵袭，在体内实验中也可以起到同样的效果。虽然丹参酮ⅡA在体内的抑瘤效果不及阿霉素，但是在抑制三阴性乳腺癌的肺转移方面具有更佳的效果。同时丹参酮ⅡA相关的实验结果可以表明，符合前期网络药理学和KEGG信号通路富集分析的预测结果。
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