摘要
目的： Treg细胞（调节性T细胞）是一种免疫抑制性T细胞，通过其免疫调节功能对免疫耐受和免疫稳态发挥着至关重要的作用，也是肿瘤细胞产生免疫逃逸的重要原因之一。无氧糖酵解所提供的ATP在实体肿瘤细胞乏氧环境中成为肿瘤细胞获取能量的重要来源，同时也是Treg细胞获得能量的重要来源之一，研究证明减少乳酸的摄入可抑制无氧糖酵解并抑制Treg细胞的增殖。单羧酸转运体1（MonocarboxylateTransporter1，MCT1）的主要功能是由细胞外向细胞内主动转运乳酸，抑制MCT1能够降低胞内乳酸的浓度，以此来达到抑制无氧糖酵解的作用。但靶向阻断MCT1后对相关信号通路所产生的一系列具体变化以及抑制无氧糖酵解后影响到信号通路的变化机理尚不明确。我们利用转录组学及代谢组学法对这一复杂过程进行生信分析，挖掘其中的关键通路，阐明这一过程中的各种信号通路及信号因子的变化。解释抑制无氧酵解对Treg细胞影响的分子机制。并进一步比对肿瘤数据库中影响肾透明细胞癌患者后的影响情况，为通过Treg细胞调节的免疫治疗肾透明细胞癌提供基础理论证据。 方法： 为了描述无氧糖酵解对Treg细胞增殖影响的潜在分子机制，以及MCT1在Treg细胞代谢中的作用，将沉默MCT1基因(Si-MCT1)的Treg细胞作为实验组，并与转染空白质粒(Si-NC)的对照组进行转录学及代谢组学的分析，转染效果通过免疫印迹实验（WesternBlot）和实时荧光实验（Reversetranscription-quantitativepolymerasechainreaction，RT-qPCR）验证；通过乳酸释放试验检测胞外的乳酸浓度，验证抑制MCT1对乳酸吸收产生是否有显著差异，利用细胞活力检测实验（Celltiter）检测无氧糖酵解的ATP（AssociationofTennisProfessional）生成量在实验组与对照组间是否有差异，通过乳酸的吸收和ATP的生成量半定量描述两组间无氧糖酵解能力的差异；通过细胞增殖实验（CellCountingKit-8，CCK-8）、细胞周期实验和细胞凋亡实验探究对Treg细胞增殖的影响。将实验组与对照组分别进行转录组学和代谢组学的测序，对差异基因及差异代谢物进行GO（GeneOntology）和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）富集分析，再将转录组学和代谢组学的富集通路取交集，筛选出共同发挥作用的关键通路及其中的目标基因，通过RT-qPCR实验再次验证目标基因的差异表达。通过TheCancerGenomeAtlas（TCGA）肿瘤基因数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）利用Cox回归的方法分析关键通路里的基因对Treg细胞免疫浸润及对肾透明细胞癌患者预后的影响情况，进一步建立该基因的表达对患者1,3,5年预期生存的回归模型，绘制Calibration曲线验证模型预测的准确性，通过CTD数据库（ComparativeToxicogenomicsDatabase）对目标基因筛选相互作用最强的相关化合物，由PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）网站搜索化合物的2D与3D结构，为肿瘤免疫治疗提供药物合成物质参考。 结果： 沉默MCT1基因通过减少细胞吸收乳酸来抑制无氧糖酵解产生ATP，从而抑制Treg细胞的增殖（P=0.0006），对照组的细胞周期比例G0/G1：30.24％，而实验组的Treg细胞周期比例G0/G1：68.67％，实验组Treg细胞复制停滞在G0/G1期。代谢组学ESI+模式和ESI-模式（筛选标准均为P＜0.05，VIP≥1）进行综合分析共鉴定出15种差异代谢物，其中上调代谢物有6种，如赖氨酸、色氨酸-精氨酸等，下调代谢物有9种，如腺苷、水苏碱等。转录组学鉴定出2232个差异表达基因（DifferentiallyExpressedGene，DEG），发现上调基因有2159个，下调基因有73个（筛选标准均为P＜0.05，|foldchange|≥2），联合转录和代谢组学结果，分析筛选后发现ATP结合转运蛋白通路（Adenosinetriphosphate–BindingCassette，ABC）通路为沉默MCT1基因条件下抑制Treg细胞增殖的关键通路（P=0.04），沉默MCT1基因后ABC通路基因均表现为表达上调并且在RT-qPCR实验中得以验证，其中通路中ABCA5，ABCB10，ABCD2（P＜0.001）以及ABCC9，ABCA1，ABCA13，ABCB1，ABCC2，ABCD3基因（P＜0.0001）发挥最重要的作用。同时联合分析发现赖氨酸生物合成、环鸟苷单磷酸蛋白激酶G信号通路、血管平滑肌收缩相关的通路与ATP的生成和细胞增殖分化有着重要的关系，也是抑制无氧酵解影响Treg细胞增殖的重要信号通路。根据TCGA癌症基因组图谱数据库发现ABC通路相关基因的表达影响肾透明细胞癌的预后，确定ABCD3基因与Treg增殖和的在肾透明细胞癌中Treg细胞免疫侵袭密切相关（P＜0.001）。把ABCD3作为关键基因用于药物化合物分析，结果显示匹立尼酸和丙戊酸相互作用系数最大（作用系数均为11），提示两种化合物可能成为免疫治疗生物制剂。 结论： 通过转录组学及代谢组学及相关生信分析证实差异性最大的ABC通路转运蛋白对Treg细胞的增殖和免疫浸润也发挥着至关重要的作用。进一步利用表达差异性最大的ABC蛋白筛选肾透明细胞癌肿瘤基因库中的目标基因，进行多因素分析发现ABC蛋白中的ABCD3基因上调表达影响Treg细胞增殖，并且具有抑制Treg细胞免疫浸润功能。因而抑制无氧酵解能够影响Treg细胞的增殖和功能，从而最终增强肿瘤免疫功能，抑制肿瘤增殖和转移。利用CTD数据库筛选而出相互作用系数最大的分子化合物匹立尼酸和丙戊酸可能成为肾透明细胞癌的免疫治疗的潜在生物制剂。
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