摘要
背景和目的：随着全球城市化进程加剧及人类生活方式的转变，肥胖人群较过去几十年呈倍数增加，且具有逐年升高趋势，然而关于肥胖的发病原因及其机制仍不清楚。目前认为，肥胖是由遗传、社会环境等各种因素引起机体能量摄入增加而消耗减少，最终造成体内白色脂肪组织（WAT）肥大及WAT，尤其是内脏脂肪过度堆积的病症。现今针对肥胖的治疗也主要围绕减少营养素摄入、增加能量消耗展开，由于引起肥胖的机制复杂，使得肥胖的发生率依旧有增无减。因此，探索新的减肥途径对于理解肥胖的发病机理及肥胖的诊治具有重要的意义。 目前已知哺乳动物体内的脂肪组织主要分为两种：WAT和棕色脂肪组织（BAT），二者均由不同的细胞类型组成，除脂肪细胞外，还包括成纤维细胞、血管、免疫细胞及神经纤维等。WAT不仅是体内储存能量的部位，也是重要的内分泌组织。BAT是哺乳动物非颤栗性产热的重要器官。当机体处于能使β3肾上腺素能神经（Adrb3）发生激活的条件时，BAT通过表达于线粒体内膜上的解偶联蛋白（UCP-1）解偶联线粒体基于质子的电化学梯度，从而使ATP生成过程解偶联，转而生成热能。近年来发现的散布于WAT的米色脂肪在活化时具有与BAT相似的功能特征。啮齿类动物研究表明，活化的BAT或促进WAT向米色脂肪转化（WAT棕色化）具有对抗饮食诱导的肥胖及代谢恶化的作用，因此找到能使BAT活性增加和WAT棕色化的方法或许能成为治疗肥胖的靶点之一。中枢神经系统在调控机体能量代谢过程中发挥重要的作用，并参与肥胖的发病过程，甚至可将肥胖定义为WAT过多或BAT功能障碍的脑部疾病。下丘脑，作为调节体温和进食过程的关键脑区，因其可整合机体的多种生理信号，近年来受到广泛关注，但关于其他脑区是否也参与调控机体能量稳态的研究相对较少。中央杏仁核（CeA）作为杏仁核的亚核，是起源于纹状体的前脑结构。研究发现，CeA除参与情绪调节、饮食偏好、成瘾行为等外，也参与机体能量代谢的调控，但CeA调控能量代谢稳态的机制尚无定论。 大量研究证实，不论是中枢神经元还是外周神经元上均分布有丰富的离子通道，瞬时受体电位通道（TRPs）即为这些离子通道的重要组成部分之一。TRPC通道作为TRP通道亚家族中的一员，分为七种亚型（TRPC1-7），分布于细胞膜上，激活后选择性地通过Na+、Ca2+等阳离子。其中TRPC5通道是非选择性Ca2+通透通道，主要分布在中枢神经系统中，如杏仁核、小脑、海马、扣带回等部位。现已表明TRPC5参与小鼠的焦虑、抑郁等情绪调节，也调控神经性疼痛。文献也报道，TRPC5通过下丘脑弓状核（Arc）的表达阿黑皮素原（POMC）神经元介导瘦素、胰岛素、血清素、利拉鲁肽等多种激素及分子发挥相应的效应，提示中枢神经系统的TRPC5可能参与机体能量稳态的调控。然而关于CeA神经元中的TRPC5在小鼠能量代谢中所发挥的功能的研究，目前仍处于空白。因此探索CeA的TRPC5在饮食诱导的肥胖中发挥的作用有助于我们对肥胖的发病机制及中枢神经系统对肥胖的影响有更新的认识。 脂肪组织中分布有丰富的神经纤维组织，尤其是交感神经纤维系统（SNS），在WAT棕色化及BAT的活化中发挥重要作用。当去甲肾上腺素（NE）从交感节后神经纤维释放后，结合脂肪细胞的Adrb3，一方面增加WAT的脂肪分解及WAT棕色化的发生，另一方面促进UCP-1介导的BAT非颤栗性产热。因此增加脂肪组织中的SNS分布及活性可拮抗肥胖的发生和进展，而调节SNS分布的中心在中枢神经系统，尤其是下丘脑，而CeA是否也参与脂肪组织中SNS的分布与活性仍缺乏报道。因此，探索CeA对脂肪组织中SNS的流出将对肥胖的临床诊治提供新的思路。 本研究分三部分进行：1，明确敲除CeA神经元中的TRPC5（以下简称敲除组，即：TRPC5KO组）后在普通饮食条件下的代谢状态。2，证实特异性敲除CeA神经元中的TRPC5可拮抗高脂饮食引起的肥胖及代谢紊乱。3，探究敲除CeA神经元的TRPC5改善高脂诱导的肥胖及代谢恶化的机制。 材料方法： 本研究以健康的雄性野生型小鼠及TRPC5flox/flox小鼠为研究对象，采用脑立体定位技术，利用携带Cre酶的腺相关病毒（AAV），特异性敲除TRPC5flox/flox小鼠CeA神经元的TRPC5基因。观察高脂饮食干预后小鼠体重、代谢状况等各项指标，从而探究CeA敲除TRPC5基因后拮抗高脂诱导的肥胖的机制。具体方法如下： 1，提取高脂饮食与普通饮食干预后小鼠CeA组织进行mRNA高通量芯片检测，探索与钙离子信号通路相关的基因。 2，观察特异性敲除CeA神经元TRPC5基因小鼠在普通饮食条件下的体重、进食量、饮水量、血压等各项基础生理指标。 3，观察TRPC5KO组小鼠在高脂饮食条件下的体重、进食量的变化。通过葡萄糖耐量、胰岛素耐量实验明确小鼠对葡萄糖的利用程度和胰岛素敏感性。 4，运用CLAMS代谢监测系统观察高脂饮食干预后的两组小鼠的耗氧量、能量消耗、活动量等反映代谢状况的指标。通过检测小鼠直肠温度观察两组小鼠核心体温。 5，检测小鼠空腹血糖。对小鼠实施安乐死之后，比较两组小鼠各个脏器的湿重及腹股沟脂肪、附睾脂肪、肩胛区BAT（iBAT）等各个部位脂肪的质量。 6，通过油红染色观察两组高脂干预后的小鼠肝脏脂肪沉积状况。对比两组小鼠WAT细胞大小及RT-PCR检测WAT产热基因表达情况。 7，运用PET/CT观察iBAT活性。通过Hamp;E染色及电镜观察iBAT的线粒体数量与脂滴大小。Oxygraph-2k高分辨率线粒体呼吸功能测定仪检测iBAT线粒体UCP-1依赖的呼吸功能。RT-PCR及WB分析iBAT产热基因和蛋白的表达水平。 8，为阐明特异性敲除CeA神经元的TRPC5改善高脂饮食引起的代谢恶化的机制，应用免疫荧光染色的方法明确两组小鼠高脂干预后脂肪组织SNS的分布情况，并用试剂盒检测脂肪组织中NE水平。 9，RT-PCR及WB分析WAT中脂肪分解及炎症基因的表达水平。冷刺激实验和肾上腺素能受体抑制实验观察小鼠产热情况，从而明确两组小鼠的产热能力。WB分析小鼠在冷暴露后BAT中产热基因的表达水平，进一步反映两组小鼠的非颤栗产热情况。 结果： 1，高脂饮食喂养的小鼠CeA组织中的钙信号通路相关基因显著上调，提示我们高脂干预后CeA神经元的钙离子发生改变且参与重要的病理生理过程。 2，TRPC5KO组小鼠在普通饮食条件下的体重、进食量、饮水量、血压等各项基础生理指标未发生明显改变。 3，TRPC5KO组小鼠可抵抗高脂饮食造成的体重增加，但进食量却较对照组（TRPC5+/+）明显增加，且敲除组小鼠的葡萄糖耐受也得到明显改善，但两组小鼠之间的胰岛素耐量未出现统计学差异。 4，TRPC5KO组小鼠的耗氧量、能量消耗及肛温明显高于TRPC5+/+组。 5，尽管两组小鼠的空腹血糖无统计学差异，但TRPC5KO组小鼠的肝脏质量及各个部位的脂肪组织质量显著低于TRPC5+/+组。 6，敲除组小鼠肝脏脂肪变性程度较对照组更轻，且敲除组脂肪细胞体积明显小于对照组。敲除组小鼠WAT的产热基因表达水平显著增加。 7，敲除组小鼠BAT活性更高，且脂滴更小，线粒体数目也较对照组更多。敲除组小鼠BATUCP-1依赖的呼吸功能增强，UCP-1等产热基因和蛋白水平明显增加。 8，TRPC5KO组小鼠的脂肪组织SNS流出增加、活性增强。 9，TRPC5KO组小鼠WAT的脂肪分解增加，炎症水平降低。冷环境暴露下，敲除组小鼠较对照组更能维持核心体温以对抗寒冷，且该效应依赖于Adrb3的激活。TRPC5KO组小鼠在冷刺激后，其BAT组织的UCP-1及PGC-1α的蛋白表达水平更高。 结论： 1，CeA特异性缺失TRPC5可拮抗高脂饮食诱导的小鼠肥胖。 2，CeA神经元的TRPC5缺失显著改善高脂饮食条件下小鼠的糖耐量，增加耗氧量和产热，其中WAT棕色化改变起关键作用。 3，CeA特异性敲除TRPC5可通过增加SNS支配和Adrb3的激活促进BAT活性和WAT棕色化。
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