摘要
第一部分唾液酸转移酶ST3GAL4介导第三代EGFR-TKI获得性耐药的作用机制及其治疗策略 研究背景 肺癌高居我国因肿瘤致死原因的首位。如今驱动基因阳性的晚期非小细胞肺癌（Non-smallcelllungcancer,NSCLC)患者已进入靶向治疗时代。以奥希替尼和阿美替尼等为代表的第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermalgrowthfactorreceptor-tyrosinekinaseinhibitor,EGFR-TKI)已广泛应用于治疗EGFR敏感突变晚期NSCLC患者，其不仅可以克服T790M引起的第一、二代EGFR-TKI耐药问题，且可应用于驱动基因阳性晚期非小细胞肺癌患者的一线治疗，有效改善该类患者的近远期疗效及生活质量。然而，随着EGFR-TKI治疗时间的推延，几乎所有患者都会出现获得性耐药。且奥希替尼等第三代EGFR-TKI耐药机制复杂，目前耐药机制研究尚不十分清楚。对于第三代EGFR-TKI耐药机制的研究，由于奥希替尼上市最早，应用最为广泛。因此目前相关研究多集中在奥希替尼的耐药机制。然而，奥希替尼耐药机制复杂，一线使用与二线使用奥希替尼的耐药机制也不尽相同。近期研究发现奥希替尼的耐药机制主要有以下方面：1、EGFR本身位点耐药突变，如C797S、L718Q、G796D突变；2、下游信号通路激活，如BRAFV600E和PIK3CA突变；3、旁路信号激活，如c-Met扩增。上述耐药机制中，又以EGFRC797S突变和c-Met扩增为最常见的耐药机制，也仅占约20%。与此同时，第三代EGFR-TKI耐药后有效治疗策略匮乏，患者耐药后治疗效果不佳，严重限制EGFR敏感突变晚期NSCLC患者的临床疗效。总之，在已知的奥希替尼耐药机制中，没有一类耐药机制有突出的发生率，更没有有效克服奥希替尼耐药的临床策略。与此同时，目前临床对于奥希替尼耐药患者多采用奥希替尼联合其他通路抑制剂的治疗方法，但效果不尽如人意。因此获得性耐药成为限制奥希替尼和阿美替尼等第三代EGFR-TKI临床疗效的瓶颈。因此，进一步研究第三代EGFR-TKI的耐药机制，并探索其耐药后治疗策略是一个亟待解决的难题。 材料与方法 本研究主要通过对多系列奥希替尼耐药细胞株进行全外显子组测序、全转录组测序和蛋白质组学分析探索发现奥希替尼可能的重要耐药机制。并通过siRNA转染、慢病毒转染、CCK8、ELISA、流式细胞凋亡检测、免疫荧光、免疫组化、侵袭实验、Westernblot和人源肿瘤细胞系移植瘤模型（Cellderivedxenografts，CDX）等实验方法验证唾液酸转移酶ST3GAL4在介导奥希替尼耐药过程中的重要作用。随后，还通过修饰组学分析寻找ST3GAL4下游关键调控蛋白c-Met的糖基化修饰位点，并采用HPLC-MS/MS检测N-糖基化位点、去糖基化突变体、IP介导的内源性泛素化测定，以阐明ST3GAL4如何调控c-Met蛋白的稳定与降解，并激活下游信号通路的详细机制。最后，我们通过高通量小分子化合物库筛选寻找有效抑制ST3GAL4的化合物，并通过人源肿瘤细胞系移植瘤模型(CDX)、人源肿瘤组织来源移植瘤模型（Patientderivedxenografts，PDX）和人体病例观察筛选所得药物对ST3GAL4介导奥希替尼耐药的治疗效果。 结果 本研究通过系列实验发现奥希替尼系列耐药细胞株中普遍存在唾液酸转移酶ST3GAL4高表达，进一步的耐药患者血液及组织标本中检测同样发现ST3GAL4高表达。通过在奥希替尼敏感非小细胞肺癌细胞系中内源性过表达ST3GAL4，我们进一步证实了过表达ST3GAL4可诱导奥希替尼获得性耐药。针对ST3GAL4如何调控奥希替尼耐药，我们对ST3GAL4过表达细胞株进行了蛋白质组学和糖蛋白修饰组学的分析，确定了c-Met是ST3GAL4诱导奥希替尼耐药的关键下游靶点。并且基于糖蛋白修饰组学的数据分析，我们发现ST3GAL4催化c-Met蛋白上的N785的糖基化位点，并拮抗K48连接的泛素依赖性c-Met降解，进而过度活化c-Met/AKT和c-Met/ERK信号通路。最后我们通过小分子化合物库筛选发现，第二代ALK-TKI布格替尼可有效抑制ST3GAL4过表达引起的奥希替尼耐药。并且相关结果在人源肿瘤细胞系移植瘤模型、人源肿瘤组织来源移植瘤模型和临床病例中得到证实。 结论 综上所述，本研究首次提出了唾液酸转移酶ST3GAL4可介导第三代EGFR-TKI奥希替尼发生获得性耐药，并阐明了ST3GAL4通过对酪氨酸激酶蛋白c-Met的N785位点糖基化修饰，提高其蛋白稳定性，降低c-Met蛋白K48相关的泛素化水平，进而激活旁路c-Met/AKT和c-Met/ERK信号通路导致奥希替尼获得性耐药的发生。除发现上述新的奥希替尼耐药调控机制外，我们通过高通量小分子药物库筛选发现第二代ALK-TKI布格替尼可有效克服ST3GAL4介导的奥希替尼耐药，布格替尼是未来有效针对ST3GAL4增高引起的奥希替尼耐药患者的后线治疗的新选择和新方向。为后续的相关临床研究开展提供了坚实的理论依据。 第二部分阿司匹林联合奥希替尼克服PIK3CA和PIK3CG突变所致奥希替尼耐药的作用及机制研究 研究背景： 第三代EGFR-TKI奥希替尼耐药机制复杂，仍有很多奥希替尼耐药患者耐药机制不明。此外，对于部分已知的奥希替尼耐药机制,目前尚无明确有效的治疗策略。因此进一步深入研究奥希替尼耐药机制以及耐药后治疗策略具有重要的科学意义和临床价值。 研究方法： 在本部分内容中，我们通过二代测序技术检测了奥希替尼耐药患者的组织或血液标本。并用人PIK3CG（L468M）或PIK3CA（H1047R）cDNA稳定转染两个小鼠原B细胞株（BA/F3），并成功在BA/F3细胞基础上成功构建了具有EGFR驱动基因的两种细胞，分别为：BA/F3-EGFRDel19和BA/F3-EGFRDel19-T790M。我们在多种奥希替尼耐药非小细胞肺癌系以及BA/F3细胞模型基础上进行了细胞增殖试验，并使用细胞系来源移植瘤模型（CDX）和患者组织来源移植瘤模型（PDX）模型来评估PIK3CG（L468M）或PIK3CA（H1047R）突变介导奥希替尼耐药的效应以及阿司匹林联合奥希替尼在体内和体外的克服上述耐药的作用。 研究结果： 在本部分研究中，我们首先观察到PIK3CG突变可导致患者对奥希替尼产生获得性耐药，并进一步通过慢病毒转染细胞实验证实PIK3CG和PIK3CA突变的确可诱导非小细胞肺癌细胞对奥希替尼耐药。机制上，PIK3CG或PIK3CA慢病毒转染后PI3Kγ或PI3Kα的表达分别上调，并激活下游蛋白激酶B（AKT）/雷帕霉素（mTOR）哺乳动物靶点和AKT/Bcl-2样蛋白11（BIM）通路，而阿司匹林可以抑制PI3K/AKT信号通路激活。最后，我们进一步通过体内研究证实，阿司匹林联合奥希替尼可以克服奥希替尼耐药CDX和PDX模型中PIK3CG或PIK3CA突变引起的奥希替尼耐药。 研究结论： 在本部分研究中，我们证实了PIK3CG或PIK3CA突变可导致奥希替尼耐药，而针对上述两种突变导致的奥希替尼耐药，阿司匹林联合奥希替尼治疗可能是有效的一种治疗方法。
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